Groundnut ringspot orthotospovirus (GRSV) em alface e novas hospedeiras : identificação de genes de suscetibilidade via análise transcritômica, busca por novas fontes de resistência natural e mobilização do gene de resistência Sw-5b do tomateiro para a alface via transgenia

Abstract

A alface (Lactuca sativa L.) é uma das principais hortaliças folhosas no mundo. As doenças causadas por isolados de diferentes espécies do gênero Orthotospovirus, incluindo a espécie Orthotospovirus arachianuali (GRSV) e Orthotospovirus tomatomaculae (TSWV) estão entre as mais importantes desta hortaliça. GRSV é a espécie viral predominante no Brasil e, até o presente momento, não estão disponíveis cultivares de alface com níveis adequados de resistência a esse patógeno. A presente tese foi organizada em nove capítulos. Os capítulos I & II apresentam uma revisão sobre os orthotospovirus e os avanços obtidos através do melhoramento clássico e biotecnológico visando resistência a esses patógenos nas culturas da alface, Capsicum e tomateiro. No capítulo III, foram conduzidos experimentos visando identificar fontes naturais de resistência genética aos orthotospovirus em germoplasma de alface cultivada e de espécies silvestres. Sessenta e cinco (65) acessos de Lactuca foram avaliados inicialmente em condições de inóculo natural. Onze acessos (apresentando baixas incidências de plantas com sintomas) foram selecionados para os ensaios em casa de vegetação via inoculação mecânica. Cinco isolados de diferentes de orthotospovirus (três isolados de GRSV e dois isolados de TSWV) foram utilizados. Três acessos avaliados apresentaram valores de baixa taxa de infecção viral. Nenhum acesso apresentou respostas do tipo imunidade. Este é o primeiro estudo identificando fontes de tolerância genética ao GRSV. No capítulo IV, uma análise transcritômica foi conduzida visando identificar genes diferencialmente expressos entre plantas inoculadas e não inoculadas durante a interação entre a cultivar suscetível ‘Salinas’ e um isolado de GRSV. O RNA total das plantas foi coletado em cinco períodos após a inoculação (1 hora, 6 horas, 24 horas, 48 horas e 7 dias). A dinâmica da replicação viral ao longo dos diferentes períodos foi determinada via PCR em tempo real (qPCR). O tempo mais adequado para análise transcritômica foi o de 48 horas após inoculação, quando ocorreu o início da multiplicação viral nos tecidos foliares hospedeiros. As amostras então foram submetidas ao processo de RNA-seq. Foram caracterizados 273 genes diferencialmente expressos nos contrastes entre plantas inoculadas versus não-inoculadas, incluindo diferentes categorias de funções gênicas relacionadas com processos de defesa de planta durante a infecção com vírus. No capítulo V, eventos transgênicos de alface contendo o gene de resistência Sw-5b do tomateiro foram desafiados em condições controladas de inoculação com um isolado de GRSV. Os eventos foram avaliados através da via análises visuais e sorológicas com posterior extração de ácidos nucléicos e PCR com primers específicos. Análises também foram conduzidas visando confirmar inserção genômica do gene Sw-5b e a presença de seus transcritos em tecido foliar de alface. As plantas transformadas com o gene Sw-5b apresentaram elevada suscetibilidade, com algumas poucas plantas assintomáticas. O produto gênico do Sw-5b e seu transcrito foram detectados tanto em plantas sintomáticas quanto em assintomáticas, indicando que a transferência do gene Sw-5b isoladamente não foi suficiente para conferir resistência ao GRSV em alface. Nos capítulos VI, VII, VIII & IX foram identificadas novas hospedeiras naturais e experimentais de GRSV. Três culturas foram relatadas como novas hospedeiras naturais, incluindo a chicória (Cichorium endivia), o almeirão (C. intybus) e a berinjela (Solanum melongena). Trinta acessos do banco ativo de jurubebas (Solanum subgênero Leptostemonum) foram desafiados com GRSV visando detectar fontes de resistência e/ou novas hospedeiras experimentais. Todos os acessos se mostraram suscetíveis. Foram relatadas como novas hospedeiras acessos de S. macrocarpon, S. acanthodes, S. viarum, S. subinerme, S. stramoniifolium e S. sisymbriifolium. Em resumo, a presente tese fornece novas informações para estabelecer estratégias mais eficazes de melhoramento genético e de manejo de doenças induzidas por orthotospovirus em alface e outras plantas hospedeiras.