Cucurbit whitefly-borne yellows virus, um recombinante de cucurbit aphid-borne yellows virus, estudos de transmissão e interação com o hospedeiro

Abstract

O Brasil é o nono maior produtor de melão no mundo, tendo a região Nordeste como a maior produtora, contribuindo com mais de 96% da produção nacional. Os estados do Rio Grande do Norte, Ceará e Bahia são os maiores produtores do fruto no país, produzindo mais de 515 mil toneladas. Das doenças que acometem a cultura do meloeiro no Brasil, as que se destacam são as viroses provocadas por potyvírus, comovírus, cucumovírus, tospovírus e carlavírus. O “Amarelão do meloeiro” é destacado como a principal doença dessa cultura, que é associada ao carlavírus Melon yellowing-associated virus (MYaV) e ao polerovírus Cucurbit aphid-borne yellows virus (CABYV). Essa doença é caracterizada por provocar em meloeiro forte clorose generalizada, reduzindo a área fotossintética da planta, o que ocasiona a redução no teor de açúcar (Brix) do fruto, prejudicando a sua comercialização, principalmente para o mercado exportador. Este estudo tem como objetivo identificar o vetor de transmissão e o círculo de hospedeiro de um isolado recombinante brasileiro de CABYV, denominado M1 (CABYV-M1) e construir uma biblioteca de cDNA de meloeiro. Para isso, foi avaliada a transmissibilidade do CABYV-M1 por mosca-branca (MEAM1) e por afídeo (Aphis gossypii). Constatou-se que o isolado CABYV-M1 é transmitido por mosca-branca (MEAM1), mas não por Aphis gossipii. Devido à sua transmissibilidade pela mosca-branca e à relação distante da proteína P3/P5 com o CABYV, o nome “cucurbit whitefly-borne yellows virus” é proposto para este CABYV recombinante brasileiro. Este se trata do primeiro relato de transmissão por mosca-branca do CABYV. Ainda, foi avaliado o círculo de hospedeiro do CABYV-M1 a partir da sua transmissão por mosca-branca. Observou-se que plantas da variedade TGR1551 de melão, abóbora e maxixe foram suscetíveis à infecção, enquanto plantas de feijão, alface, pepino, melancia e beterraba não foram suscetíveis ao CABYV-M1. Em relação a síntese do clone infeccioso de CABYV-M3, utilizando a metodologia de Gibson Assembly, foi possível obter dois clones infecciosos de CABYV-M3, denominados CABYV-M3a e CABYV-M3b. A infecciosidade dos clones foi confirmada por RT-PCR e sequenciamento. Plantas de meloeiro (cv. Goldex) agroinoculadas com os clones infecciosos CABYV-M3a e CABYV-M3b apresentaram sintomas típicos da doença ‘Amarelão’. Foi feito também o teste do clone infeccioso CABYV-M3a em um círculo de hospedeiro somente com cucurbitáceas e constatouse que plantas de abóbora híbrida cv. Tetsukabuto, abóbora cv. Moranga Coroa, maxixe e melão amarelo híbrido cv. Goldex e cv. Calábria foram suscetíveis à infecção. Para a construção da biblioteca de cDNA de meloeiro foi utilizado o kit CloneMiner II cDNA Library Construction (Thermo Fisher Scientific). A biblioteca de cDNA de meloeiro obtida no vetor pDORN22 referente a amostra 1, foram contadas 678, 338 e 12 colônias e para a amostra 2, 724, 338 e 7 colônias nas diluições 1:100, 1:1000 e 1:10.000, respectivamente. A titulação final obtida para a biblioteca de cDNA foi de 2,1 x 107 para a amostra 1 e 5,7 x 107 para amostra 2, sendo consideradas eficientes. Após, a biblioteca obtida no vetor pDORN22 foi transferida para o vetor pDEST22. Em pDEST22, a biblioteca obtida nas titulações 1:100, 1:1000 e 1:10.000 foram de 797, 695 e 105, para a amostra 1, e 1258, 592 e 192, para amostra 2. A média das titulações nas mesmas diluições foram de 6 x 106 , para a amostra 1, e 8,8 x 106 , para a amostra 2. O resultando total da CFU para a amostra 1 e 2, respectivamente, foram de 7,2 x 107 e 10,5 x 107 , representando valores acima do considerado para uma biblioteca eficiente, que é no mínimo de um quociente a 106 . Por fim, para finalizar a confirmação da eficiência da biblioteca de cDNA de meloeiro, foram selecionados 10 clones em pDEST22 (vetor final) para sequenciamento Sanger das amostras 1 e 2, sendo cinco de cada amostra. Todas as 10 amostras apresentaram sequências de Cucumis melo quando comparadas com sequências depositadas no GenBank, confirmando a eficiência da biblioteca. Como conclusão, a mosca-branca é o vetor natural de CABYV; os clones CABYV-M3a e CABYV-M3b são infecciosos; as variedades de melão, maxixe e abóbora são plantas suscetíveis ao CABYV; e a biblioteca de cDNA de meloeiro foi construida.