Rinovírus no Distrito Federal : caracterização epidemiológica e molecular por sequenciamento de alta performance

Abstract

Infecções do trato respiratório estão associadas a um elevado índice de morbidade e mortalidade em todo o mundo, sendo os vírus os principais agentes etiológicos envolvidos. A implantação do Sistema Sentinela de Vigilância da Influenza e outros vírus teve início no ano 2000 no Brasil e é constituída por laboratórios centrais de saúde pública os quais são responsáveis pelo monitoramento pela identificação desses agentes virais. A metodologia utilizada para diagnóstico de vírus respiratórios é o RT-qPCR, o qual identifica apenas alvos específicos, resultando em diagnóstico inconclusivo para muitas amostras. Assim, o sequenciamento de alta performance (high-throughput sequencing, HTS) seria um método complementar na identificação de patógenos em amostras inconclusivas para RT-qPCR ou outros protocolos de detecção específicos. Vírus como os rinovírus humano (HRV) tinham sua incidência e relevância subestimadas pela ausência de alvos específicos. Estes vírus são patógenos virais humanos comuns relacionados a infecções do trato respiratório superior e inferior, que podem resultar em bronquiolite e pneumonia. Caracterizar aspectos epidemiológicos e moleculares dos rinovírus por HTS pode ser útil para compreender as formas de circulação e como ocorrem as interações entre eles e a população de Brasília, Distrito Federal, fortalecendo a rede de vigilância de vírus respiratórios (RVVR). Objetivos: Este estudo teve como objetivo detectar vírus não identificados por RT-qPCR utilizando a abordagem HTS em amostras de nasofaringe / secreção traqueal coletadas no Distrito Federal, Brasil. A identificação dos rinovírus como principal agente etiológico por HTS

nessas amostras permitiu analisar as características clínicas e os desfechos de pacientes HRV- positivos por RT-qPCR com primers desenvolvidos neste estudo, verificar o aprimoramento da

definição de agentes etiológicos pela rede de vigilância, além de avaliar a ocorrência de rinovírus em determinados períodos. Metodologia: Os ácidos nucléicos foram extraídos de amostras coletadas no período de inverno de 2016 e submetidas ao HTS. Os resultados foram confirmados pelo multiplex PR21 RT-qPCR, que identifica 21 patógenos respiratórios. Novos conjuntos de primers específicos foram desenhados e utilizados para detecção de rinovírus por RT-qPCR e sequenciamento Sanger de cDNA amplificado da região genômica 5 ́, com posterior análise de filogenia de isolados representativos de HRV. RT-qPCR foi usado para monitorar a presença de vírus respiratórios,

incluindo rinovírus no painel de vírus respiratórios, em amostras de pacientes com Síndrome Gripal (SG) ou Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS). Perfis de amostra foram obtidos a fim de correlacionar com os resultados da detecção dos vírus avaliados. A análise estatística considerando o perfil dos pacientes e a correlação da incidência de rinovírus com os dados meteorológicos foram realizadas por meio do programa IBM SPSS com testes não paramétricos. Resultados: Os principais vírus identificados pelo HTS foram das famílias Herpesviridae, Coronaviridae, Parvoviridae e Picornaviridae, com destaque para os rinovírus. A presença de vírus respiratórios nas amostras foi confirmada pelo multiplex RT-qPCR PR21. Coronavírus, enterovírus, bocavírus e rinovírus foram encontrados por multiplex RT-qPCR, bem como por análises HTS. O vírus mais prevalente, em amostras previamente negativas para vigilância da Influenza e outros vírus, foi o rinovírus (n = 40), incluindo as três espécies de rinovírus (rinovírus A, B e C). A razão de chance associada à infecção por HRV foi de 2,160 para pacientes com menos de 2 anos e de 4,367 para pessoas que vivem em áreas rurais. O principal sintoma associado à infecção pelo vírus foi a rinorreia. A análise múltipla mostrou associação também para menos casos de desconforto respiratório em pacientes HRV-positivos. A adição de primers específicos para rinovírus no painel de vírus respiratório aumentou significativamente a identificação de um agente etiológico viral. A prevalência de rinovírus (em relação aos demais vírus) apresentou correlação negativa significativa com as temperaturas mínimas, ou seja, o aumento da detecção de rinovírus é proporcional à diminuição das temperaturas mínimas registradas em Brasília, Brasil. Conclusão: Grande diversidade de vírus foi encontrada por diferentes metodologias e alta frequência de ocorrência de rinovírus foi confirmada na população no inverno, mostrando sua relevância para a saúde pública. A presença de rinovírus em doenças respiratórias foi significativamente associada à idade menor que dois anos e à rinorreia. A incidência de rinovírus foi correlacionada com a queda da temperatura mínima, mas sem um padrão sazonal evidente para a população de Brasília no período estudado.