Pepper ringspot virus : estudo da resposta imune em Nicotiana benthamiana e utilização como vetor para produção de antígeno específicos contra Coguvírus

Abstract

Os vírus Coguvirus citrulli e C. henanense, conhecidos como watermelon crinkle leaf-associated virus (WCLaV-1 e WCLaV-2), pertencem ao gênero Coguvirus e foram recentemente detectados em plantas de melancia no Brasil, frequentemente em coinfecção com Orthotospovirus arachianuli (groundnut ringspot virus, GRSV). Plantas infectadas por WCLaVs e GRSV apresentaram sintomas de mosaico, enrolamento e redução do limbo foliar. Apesar da severidade dos sintomas, ainda há informações limitadas sobre a epidemiologia da doença no Brasil, incluindo perdas de produção, hospedeiros alternativos e vetores de transmissão. Para elucidar esses aspectos, é essencial dispor de ferramentas sensíveis e específicas para a detecção desses vírus. Neste contexto, este estudo teve como objetivo desenvolver anticorpos policlonais específicos contra WCLaV-1 e WCLaV-2. A estratégia adotada baseou-se na produção das proteínas do nucleocapsídeo (N) de WCLaV-1 e WCLaV-2 utilizando o vetor pepper ringspot virus (PepRSV) em Nicotiana benthamiana para expressão heteróloga. As proteínas recombinantes foram injetadas em coelhos, e os antissoros resultantes foram avaliados quanto à especificidade por dot-immunobinding assay (DIBA), antigen-coating ELISA, tissue blot immunobinding assay (TBIA) e Western blot. Além disso, análises de ELISA indicaram que WCLaV-1 apresentou uma taxa de infecção de 93,1% em sementes comerciais da cultivar 'Crimson Sweet', enquanto WCLaV-2 foi detectado em apenas 17,8%. A análise por TBIA confirmou a presença de WCLaV-1 em sementes e plântulas, e a microscopia confocal revelou que a proteína N de WCLaV-1 estava predominantemente localizada no citoplasma dos tecidos da semente, sendo também detectada no núcleo das células da ponta da raiz. Os clones infecciosos do PepRSV, compostos por dois segmentos genômicos (RNA1 e RNA2), foram clonados no vetor binário pJL89. A agroinfiltração desse clone infeccioso via Agrobacterium tumefaciens em N. benthamiana resulta em infecção sistêmica, permitindo o uso do PepRSV como vetor viral para expressão heteróloga de proteínas. Esse sistema possibilita a substituição do gene da capa proteica (CP) do PepRSV pelo gene de interesse, permitindo, por exemplo, a expressão da CP de outro vírus em plantas infectadas. Durante experimentos com o clone infeccioso do PepRSV, um mutante do RNA2, denominado clone 4, foi identificado. Esse mutante apresentava uma mutação atípica, caracterizada pela inserção de uma citidina na extremidade 3’ do gene da CP. A inoculação do clone 4 em N. benthamiana resultou na formação de lesões necróticas locais, um fenômeno semelhante à reação de hipersensibilidade “HR-like”. Em contraste, outro clone do RNA2, denominado clone 2, que apresenta a sequência genômica do tipo selvagem, induziu infecção sistêmica sem causar lesões locais. Diante da relevância desse achado, foram conduzidos estudos para compreender o mecanismo subjacente à indução da resposta “HR-like” pelo clone 4. Os experimentos buscaram avaliar a resposta imune de N. benthamiana infiltrada com o clone 4, investigando a ativação de espécies reativas de oxigênio, com ênfase no acúmulo de peróxido de hidrogênio, a deposição de calose, a expressão de genes relacionados à defesa via RT-qPCR e o impacto do nocaute do gene SGT1. Os resultados indicaram que plantas inoculadas com o clone 4 apresentaram acúmulo de peróxido de hidrogênio e deposição de calose, enquanto plantas infectadas pelo clone 2 mostraram apenas deposição de calose. Além disso, a expressão de genes indicadores de defesa foi maior em plantas infectadas pelo clone 4, e o nocaute do gene SGT1 foi detectado. No entanto, análises adicionais ainda são necessárias para esclarecer os mecanismos envolvidos e determinar se a resposta de defesa ocorre predominantemente via imunidade desencadeada por padrões (PTI) ou mediada por efetores (ETI). Os resultados deste estudo fornecem informações para o diagnóstico e compreensão da epidemiologia dos WCLaVs na cultura da melancia, destacando a transmissão por sementes como um fator relevante. Além disso, contribuem para o avanço no uso do PepRSV como vetor viral para expressão de antígenos e para a investigação das respostas imunes em Nicotiana benthamiana. A caracterização do clone 4 do PepRSV amplia o conhecimento sobre os mecanismos de defesa vegetal, permitindo novas abordagens para o estudo da interação vírus-planta e do desenvolvimento de estratégias de controle.