Expressão heteróloga de proteínas quiméricas contendo peptídeos antimicrobianos

Abstract

As proteínas podem conter sequências internas de peptídeos com atividades biológicas que variam desde ação antioxidante à anti-inflamatória e opioide. Os peptídeos provenientes de sequências internas de proteínas com atividades semelhantes aos antimicrobianos (PAM), presentes em várias espécies, têm sido sistematicamente investigados, devido ao seu amplo espectro de ação contra fungos e bactérias, principalmente. Desse fato experimental inconteste, surgiu então o conceito de Peptídeos Intragênicos (PI), peptídeos antimicrobianos, ou com outras atividades biológicas que estavam “encriptados” em sequências tipicamente reconhecidas como tão-somente codificadoras de proteínas detentoras das mais variadas funções biológicas no genoma de inúmeros seres vivos. Um trabalho anterior de nosso grupo validou a ação de seis dos PI antimicrobianos (Gr01, Gr02, Tc01, Tc02, At01 e At04) usados nessa pesquisa e encontrados nos genomas do cacau (Theobroma cacao), algodão (Gossypium raimondii) e Arabidopsis thaliana. Eles foram identificados usando o Kamal, software que faz buscas em bancos de sequências de proteína por padrões de sequências de aminoácidos que apresentem características físico-químicas compatíveis com a atividade biológica de interesse. A hipótese do presente estudo é de que seria possível “reencriptar” esses peptídeos em uma forma gênica diferente daquelas nas quais eles foram encontrados e remodelá-los numa nova forma de estruturas proteicas quiméricas para que, possivelmente, sua atividade biológica fosse silenciada temporariamente e, com isso, possibilitasse uma estratégia para expressão heteróloga em Escherichia coli. Ademais, foram produzidos de forma recombinante dois peptídeos encriptados provenientes do genoma do café (Coffea canephora): Cc00 e Cc11, ambos putativamente bioativos para outra atividade de interesse do grupo. Surpreendentemente, Cc11 mostrou atividade antimicrobiana. Neste trabalho, foram produzidas e detectadas por Western Blot duas quimeras antimicrobianas contendo esses peptídeos. A quimera GST_Gr01 foi parcialmente produzida, purificada e sequenciada. Como validação do sistema de expressão, o peptídeo não antimicrobiano Cc00 foi produzido e parcialmente sequenciado por MALDITOF/MS. Verificou-se que o peptídeo foi completamente processado e integralmente expresso, apresentando os resíduos correspondentes ao encontrado no genoma e a massa molecular predita. Ademais, em Komogataella phaffii, outro modelo de trabalho, foi observado inibição do crescimento da levedura induzida para expressão do PAM de anfíbio DS 01. Um ensaio de MIC preliminar demonstrou a susceptibilidade de K. phaffii à DS 01.