Modificações conformacionais da associação entre o SPCI e a a-quimotripsina

Abstract

"O inibidor de quimotripsina de Schizolobium parahyba (SPCI) pertence à família Kunitz, inibindo especificamente quimotripsina na proporção molar de 1:1 (Ki = 5,85 x 10-8 M). Este trabalho visa analisar as modificações conformacionais resultantes da associação entre o SPCI e a -quimotripsina por meio de métodos espectroscópicos de fluorescência (estacionária e dinâmica), dicroísmo circular e espalhamento de luz dinâmica (ELD); a cristalização do complexo binário SPCI-quimotripsina também foi realizada utilizando o método da matriz esparsa em gota sentada. O SPCI foi purificado pela precipitação com ácido tricloroacético 1,2% seguido por cromatografia de troca catiônica. A purificação do complexo binário foi realizada por cromatografia de exclusão molecular. O espectro da emissão na interação das moléculas apresentou atenuação da intensidade da fluorescência fixa a max = 332. O gráfico de Stern-Volmer apresentou KSV (103 M-1) praticamente constante em diferentes temperaturas, excluindo a hipótese de atenuação estática ou dinâmica. O decaimento de fluorescência do SPCI ( 1 = 0,67 ns e 1 = 0,52; 2 = 4,98 ns e 2 = 0,45) e da -quimotripsina ( 1 = 0,88 ns e 1 = 0,37; 2 = 4,16 ns e 2 = 0,67) foram melhores ajustadas pelo modelo Discreto e Planck para dois tempos de vida baseado no valor mínimo do 2. Os parâmetros obtidos indicam que a -quimotripsina apresenta duas populações distintas de triptofano: enterrada ( 1) e exposta ( 2); o decaimento bi-exponencial encontrado para o SPCI indica subestados conformacionais do triptofano no estado excitado. A interação do inibidor com a quimotripsina foi analisada através da clássica equação de Stern-Volmer. A interação provocou modificações conformacionais nos micro-ambientes dos triptofanos do complexo, aumentando (redução da hidrofobicidade) e atenuando (aumento da hidrofobicidade) o tempo de vida. Essa modificação foi dependente da concentração da enzima. Os cálculos para Kq (1012 M-1s-1) mostraram que a atenuação registrada pela fluorescência estacionária e dinâmica ocorre por ligação molecular. Os experimentos de ELD mostraram que o SPCI apresenta forma monomérica em solução, independente da concentração, pH e temperatura. Portanto, a atenuação do tempo de vida do complexo é devido provavelmente a estados oligoméricos mais complexos (tetrâmero) da enzima. A presença de NaCl 0,2 M reduziram os valores do tempo de vida para ambas as moléculas separadamente, provavelmente pela redução das interações dos triptofanos com os resíduos circunvizinhos. O sal potencializou a atenuação do tempo de vida acima de 20 M da enzima. A análise do papel das ligações dissulfeto na interação também foi realizada. O gráfico de Stern-Volmer mostrou flutuação ao longo da titulação da quimotripsina, sugerindo flexibilidade conformaconal do SPCI nessas condições. A desnaturação térmica do inibidor não foi possível, mostrando que as ligações dissulfeto não são responsáveis pela estabilidade estrutural do inibidor. As reduções dessas ligações promoveram modificações em valores percentuais na estrutura secundária, o que poderá explicar a flexibilidade conformacional registrada na flutuação gráfica de Stern-Volmer. O cristal do complexo binário do SPCI com -quimotripsina difratando a 2,8 Å foi obtido na condição MES/NaOH 100 mM pH 5.5, PEG 6000 20% (w/v), LiCl2 200 mM e sulfobetaína não-detergente 201 (NDSB-201) como aditivo." . _________________________________________________________________________________ ABSTRACT

"The inhibitor of chymotrypsin Schizolobium parahyba (SPCI) belongs to the Kunitz family, specifically inhibit chymotrypsin at molar ratio of 1:1 (Ki = 5.85 x 10-8 M). This paper aims to analyze the conformational changes resulting from the association between the SPCI-chymotrypsin and by means of fluorescence spectroscopic methods (stationary and dynamic), circular dichroism and dynamic light scattering (SLS), the crystallization of binary SPCI-chymotrypsin complex was also performed using the sparse matrix method in sitting drop. The SPCI was purified by precipitation with trichloroacetic acid 1.2% followed by cation exchange chromatography. The purification of the binary complex was performed by size exclusion chromatography. The emission spectrum of the interaction of the molecules showed attenuation of the fluorescence intensity of fixed max = 332. The Stern-Volmer plot showed KSV (103 M-1) almost constant at different temperatures, without the possibility of static or dynamic attenuation. The decay of fluorescence of GSI (1 = 0.67 ns and 1 = 0, 52, 2 = 4.98 ns and 2 = 0.45) and-chymotrypsin (1 = 0.88 ns and a = 0.37, 2 = 4.16 ns and 2 = 0.67) were better adjusted by Discreet and Planck model for two life times based on the minimum value of 2. The parameters obtained indicate that a-chymotrypsin shows two distinct populations of tryptophan: buried (1) exposed and (2), the bi-exponential decay found for the GSI indicates conformational substates in the excited state of tryptophan. The interaction of the inhibitor with chymotrypsin was analyzed by the classical Stern-Volmer equation. conformational changes triggered interaction in micro-environments of the tryptophans in the complex, increasing (reducing hydrophobicity) and damping ( increased hydrophobicity) the lifetime. This modification was dependent on the concentration of the enzyme. Calculations for KQ (1012 M-1s-1) showed that the fluorescence decay recorded for stationary and dynamic molecular link occurs.'s experiments showed ELD SPCI presents the monomeric form in solution, independent of concentration, pH and temperature. Therefore, the attenuation of the lifetime of the complex is probably due to more complex oligomeric state (tetramer) of the enzyme. The presence of 0.2 M NaCl reduced values ​​of lifetime for both molecules separately, probably by reducing the interactions of tryptophans with the surrounding residues. Salt enhanced the attenuation of lifetime above 20 M of the enzyme. The analysis of the role of disulfide bonds in the interaction also was performed. The Stern-Volmer plot showed fluctuation along the titration of chymotrypsin, suggesting flexibility conformaconal of SPCI under these conditions. The thermal denaturation of the inhibitor was not possible, showing that the disulfide bonds are not responsible for the structural stability of the inhibitor. The reductions of these links have promoted changes in percentages of the secondary structure, which may explain the conformational flexibility in the fluctuation recorded graphic Stern-Volmer. The crystal of the binary complex with SPCI-chymotrypsin diffracting to 2.8 Å was obtained on condition MES / 100 mM NaOH pH 5.5, 20% PEG 6000 (w / v), 200 mM LiCl2 sulfobetaína non-detergent and 201 (NDSB-201) as an additive. "