Clonagem, expressão heteróloga, purificação e caracterização funcional da endoglicanase A de Aspergillus nidulans

Abstract

O Bioetanol é um combustível alternativo particularmente interessante, pois paralelamente às técnicas já estabelecidas pela indústria sucroalcooleira no Brasil, são geradas imensas quantidades de bagaço-de-cana, um resíduo bastante sub-aproveitado. Este pode apresentar de 40 a 50% de celulose, polímero resultante da repetição de unidades de Dglicose unidas por ligações ß-1,4. Estas podem ser alvo de enzimas celulolíticas produzidas principalmente por fungos filamentosos. O emprego de estratégias envolvendo sistemas heterólogos para produção destas enzimas pode favorecer o alcance dos níveis máximos de produção em prazos inferiores aos observados em sistemas nativos, além de facilitar a purificação da proteína recombinante. Neste trabalho, foi realizada a caracterização parcial da endoglicanase A (EG A) de Aspergillus nidulans, enzima de interesse biotecnológico incluída no projeto da rede Bioetanol (MCT/FINEP), onde nosso grupo desenvolve a meta de “Produção de celulases recombinantes em sistema heterólogo de Pichia pastoris”. As construções para clonagem envolveram promotores induzíveis por metanol, sendo o vetor de expressão obtido dirigido para integração no genoma de P. pastoris. Assim, após clonagem e transformação desta levedura metilotrófica, foi realizada a expressão heteróloga desta enzima seguida de sua purificação parcial. Empregando o sobrenadante dos clones recombinantes, foi obtido um produto heterólogo com atividade máxima em carboximetilcelulose (CMC) a partir de 24 h de indução. Após purificação empregando ultrafiltração e filtração em gel, a enzima recombinante foi caracterizada, atuando preferencialmente em pH ácido (de 4,5 a 5,0) e temperatura próxima a 50oC, em torno da qual esta enzima apresentou-se termoestável a 45 e 55oC por cerca de 48 h. Foi observado um incremento de 30 a 80% nos valores de atividade diante da incubação com Co2+, DTT e ß-mercaptoetanol. A degradação de substratos alternativos mostrou-se significativa somente na incubação com CMC e, em menor extensão, em papel de filtro. Além disso, a análise de atividade em gel e o perfil eletroforético das amostras das etapas da purificação confirmaram a massa molecular de 34 kDa, conforme esperado. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Bioethanol is an alternative fuel of particular interest because in Brasil, the techniques used in fuel industry generate an enormous amount of a by-product, which could be further degraded: the sugarcane bagasse. It can presents 40-50% of cellulose content, which is a polymer composed by repeated units of D-glucose, linked by ß-1,4 bonds. These bonds can be cleaved by cellulolytic enzymes produced specially by filamentous fungi. The use of heterologous expression strategies to produce these enzymes can be advantageous in order to higher levels of production in shorter periods compared as those observed with wild type enzymes, besides the feasibility of recombinant protein purification methods. In this work, we describe the partial characterization of endoglucanase A (EG A), produced by Aspergillus nidulans. On account of the biotechnological interest, this enzyme was included in the project of the Bioethanol net (MCT/FINEP), and our group was responsible for developing the “Recombinant cellulases production employing Pichia pastoris as a heterologous expression system. The cloning vector was constructed using methanol-induced promoters, with the foreign DNA being directed to be integrated in the Pichia pastoris genome. Finally the enzyme was partially purified and characterized. To examine whether higher levels of activity towards CMC would occur, we used the supernatant of the recombinant clones. We observed the highest level of activity after 24h of induction. After ultrafiltration and gel filtration purification procedures, we characterized an enzyme that acts preferentially at pH 4, which is thermostable at a temperature of approximately 50ºC. It was observed an increased enzyme activity when the enzyme was incubated in the presence of Co2+, DTT and ß-mercaptoethanol. The hydrolysis of lignocellulosic substrates was significant only with CMC and, at a lesser extent, with filter paper. Also, the analysis of activity in gel and the electrophoretic profile of the purified samples confirmed the molecular mass of 34 kDa, as predicted.