Análise proteômica de Trypanosoma cruzi : construção de mapas bidimensionais em pH alcalino

Abstract

O Trypanosoma cruzi é o parasita causador da doença de Chagas, a qual atinge 16-18 milhões de pessoas. Recentemente, o seqüenciamento do genoma do T. cruzi foi concluído, o que deu novo impulso aos projetos pós-genômicos visando a elucidação da expressão diferencial de proteínas ao longo do ciclo de vida do parasita. A proteômica é bastante apropriada para este fim, já que a regulação da expressão de proteínas em T. cruzi ocorre em nível póstranscricional. Objetivando-se o estudo das proteínas básicas do proteoma de T. cruzi, condições para eletroforese bidimensional (2-DE) em pH alcalino das formas epimastigotas, tripomastigotas e amastigotas foram estabelecidas. Tornou-se necessário otimizar as condições experimentais para tais géis, já que nessa faixa de pH é normal o aparecimento de longas listras horizontais (streaking), baixa resolução de spots e baixa reprodutibilidade. O protocolo final, desenvolvido para formas epimastigotas, consistiu na adição de 10% de isopropanol ao tampão de reidratação do gel de gradiente imobilizado de pH, aplicação da amostra em uma fita de papel de filtro conectada ao anôdo, uso de fita embebida com solução de DTT junto ao catôdo e focalização isoelétrica utilizando-se o equipamento Multiphor II (GE Healthcare). Um total de 10 spots do gel de epimastigotas foram identificados por impressão digital do mapa peptídico (peptide mass fingerprint). As proteínas identificadas foram: fosfoglicerato quinase, prostaglandina F2a sintase, peptídeo metionina sulfóxido redutase, metiltioadenosina fosforilase, proteína dissulfeto isomerase, AKB ligase e quatro proteínas hipotéticas (hipotéticas). As condições padronizadas para a 2-DE foram aplicadas na construção de mapas bidimensionais das formas tripomastigotas e amastigotas. Os mapas resultantes permitiram verificar diferenças de expressão entre os proteomas. Por último, foi testada a metodologia do gel “dois em um” para 2-DE em faixa ampla de pH, que mostrou resultados promissores para futuras análises da expressão comparativa de proteínas em T.cruzi.