Estratégias para investigação do efeito do gene LMX1B na síndrome de unha patela : CRISPR-Cas9 e diferenciação condrogênica

Abstract

As doenças genéticas esqueléticas são um conjunto de doenças que podem afetar desde os ossos até os tecidos, possuindo uma manifestação clínica muito variável; são majoritariamente incuráveis e dependem de tratamentos paliativos. A Síndrome de Nail-Patella (NPS; OMIM: 161200) é uma anomalia autossômica dominante causada por mutações em heterozigose no gene LMX1B, e apesar de possuir sinais clínicos bem descritos pouco se compreende sobre seus mecanismos moleculares. Este projeto teve como objetivo principal o desenvolvimento de ferramentas para estudo da NPS usando CRISPR-Cas9 e condrogênese. Devido à expressão precoce do gene durante a embriogênese, células-tronco de pluripotência induzida (iPSC) foram inicialmente escolhidas para o projeto, visando sua edição por meio do sistema CRISPRCas9. No entanto, devido à complexidade dos custos associados à cultura de iPSC, células estromais mesenquimais (CEM) e células renais embrionárias (HEK293T) foram escolhidas como alternativa. Testes com plasmídeos de fluorescência utilizando Lipofectamine™ e Nucleofector™ demonstraram que tanto as iPSC como as CEM foram viáveis para a entrega de plasmídeos, apesar da taxa de transfecção inferior à literatura. A inserção dos plasmídeos com sgRNA aumentou a mortalidade celular, bem como a inserção da puromicina para a seleção dos clones, dessa forma levanta-se a possibilidade da deleção do gene ser letal para as células. Concomitantemente foi realizada a otimização da diferenciação condrogênica de células iPS, facilitando o estudo de doenças genéticas do esqueleto a partir de células pluripotentes. No tocante à expressão gênica, observou-se que durante a condrogênese o gene SOX9, iniciador da condrogênese, apresenta o mesmo perfil de LMX1B, sugerindo sua associação. Para análise do perfil de expressão do gene em células renais utilizou-se as HEK293T Cas9 estáveis e resistentes à puromicina, coletando-se seu material após transfecção com sgRNA de interesse e analisando perturbações no genoma. Este projeto possibilitou a definição de protocolos para transfecção de iPSC e CEM, bem como HEK293T, demonstrando seu potencial de inserção de plasmídeos. Além disso foi definido também um novo protocolo para diferenciação condrogênica de iPSC e dados de qPCR evidenciaram ligação entre a expressão de SOX9 e LMX1B, esses achados abrem portas para o estudo de doenças genéticas do esqueleto em sistemas in vitro utilizando diferentes estratégias de entrega do CRISPR-Cas9.