Avaliação de estratégias genéticas para a melhoria da produção de ácido lático em cepas da levedura Komagataella phaffiii

Abstract

O ácido lático é classificado como um químico plataforma devido às numerosas aplicações a que pode ser destinado industrialmente. Nos anos recentes, a maior parte da produção do ácido lático tem sido destinada à síntese do polímero polilactídeo (PLA), um bioplástico termoestável e compostável que pode ser uma alternativa sustentável aos plásticos convencionais derivados de petróleo. Uma das vias de obtenção do ácido lático é através da fermentação microbiana utilizando fontes de carbono renováveis. Porém, a produção via fermentação microbiana requer melhorias no bioprocesso para que o PLA se torne comercialmente competitivo. Em trabalhos anteriores do nosso grupo, a levedura Komagataella phaffii demonstrou capacidade de utilizar em fermentar o glicerol bruto, um subproduto da indústria do biodiesel. Assim, K. phaffii foi selecionada para a construção de linhagens produtoras de L-lactato, atingindo até o momento, o rendimento de 0,67 (g/g) em batelada-alimentada em hipóxia. Ao avaliar as cepas de K. phaffii construídas, há indícios de que as modificações anteriores, como a deleção da piruvato descarboxilase 1, resultam em um desbalanço do equilíbrio redox NADH/NAD+ o que poderia explicar a produção de arabitol como coproduto e a dificuldade em melhorar o rendimento de ácido lático. Portanto, diferentes alvos para expressão e nocaute foram avaliados neste trabalho com o objetivo de (a) corrigir o balanço redox na cepa GLp para evitar a redirecionamento do fluxo para vias competitivas; (b) viabilizar a produção de ácido lático em aerobiose; (c) avaliar diferentes LDHs e (d) superexpressar o gene responsável pelo transportador de lactato, Jen1. Na manipulação genética de K. phaffii, foi possível observar que (i) a utilização da técnica de amplificação do círculo rolante para amplificação de material genético resultou em uma maior obtenção de clones; (ii) a inserção de regiões de repetições diretas para guiar a excisão se mostrou eficaz para a reciclagem de marca; (iii) integrações em locus com regiões repetidas resulta em instabilidade da integração. Em relação aos alvos testados para melhorar a produção de ácido lático, concluímos que a deleção do gene do transportador mitocondrial de piruvato em K. phaffii não foi vantajosa, visto que houveram impactos deletérios no crescimento sem ganhos na produção de ácido lático. As observações deste trabalho indicam que a cepa GLp cultivada em batelada-alimentada e com limitação de oxigênio é ainda a melhor candidata para a produção de ácido lático a partir de glicerol.