Desenvolvimento de sistemas de regulação da expressão gênica em leveduras baseados em optogenética e no uso de serina integrases

Abstract

A levedura Komagataella phaffii (Pichia pastoris) tem sido utilizada como uma plataforma de produção de proteínas heterólogas há mais de 20 anos por apresentar níveis elevados de expressão gênica pelo uso do promotor do gene AOX1 (PAOX1) induzido por metanol, dentre outras vantagens. Entretanto, o metanol, indutor químico, é tóxico e inflamável. Nos últimos anos, a optogenética tornou-se uma ferramenta muito utilizada para a regulação de processos biológicos, como: expressão gênica, localização de proteínas, transdução de sinais e interações proteína-proteína. Baseia-se na utilização da luz, um indutor físico, para o desenvolvimento de sistemas reguláveis. A aplicação de um circuito optogenético em K. phaffii para a regulação da expressão gênica permite utilizar um sistema induzido que não afeta o metabolismo da levedura e nem sofre interferência do metabolismo celular. No presente projeto, buscamos pela primeira vez o desenvolvimento de um circuito optogenético na levedura Komagataella phaffii responsivo a luz vermelha utilizando o fator de transcrição Mit1, presente na regulação do promotor do AOX1 como um dos componentes do sistema. Esse sistema foi baseado na interação responsiva à luz vermelha de proteínas de fusão que se ligam ao promotor PAOX1. O sistema optogenético foi construído com sucesso requerendo, todavia, ajustes metodológicos para sua implementação. Outro sistema de regulação estudado neste trabalho foi baseado no uso de integrases, uma classe de proteínas virais que mediam a integração e a excisão dos fagos no genoma. Recentemente, foram caracterizadas 11 integrases ortogonais e não há relatos de sua utilização na construção de circuitos na levedura Saccharomyces cerevisiae até o momento. Esta levedura é reconhecida como modelo para o estudo da biologia dos organismos eucariotos, sendo um dos microrganismos mais estudados e caracterizados. Após analises de ortogonalidade, foi feita a análise funcional da integrase 13, junto com a integrase 4 sob o controle do promotor responsivo a galactose. Estas integrases apresentaram a capacidade de ativar o dispositivo genético abrindo caminho para sua utilização como novas ferramentas moleculares para o desenvolvimento e construção de circuitos sintéticos. Por último, foi combinado o sistema de regulação com as integrases com o sistema optogenético com o objetivo de ter um sistema duplamente regulado. O sistema final obtido apresentou-se funcional necessitando ainda ajustes nas condições de exposição à luz vermelha/escuridão.