Caracterização molecular de fragmentos de anticorpos anti-ssDNA obtidos a partir de uma biblioteca combinatória de genes variáveis de galinha

Abstract

Os anticorpos anti-DNA são comumente encontrados nas doenças auto-imunes. Vários estudos têm sido realizados com o objetivo de se determinar as bases moleculares desse reconhecimento antigênico. Em trabalhos anteriores construíu-se uma biblioteca combinatória de fragmentos de anticorpos, a partir de cDNA de galinhas da raça Red/Black Cornish Cross, previamente imunizadas com BSA-fluoresceína. Os scFvs foram selecionados pela sua capacidade de ligação a DNA fita simples (Oligo dT-celulose) (Maranhão, 2001). A partir daí, quatro clones foram escolhidos. Esses scFvs foram novamente seqüenciados e analisados. Os fragmentos de anticorpos foram produzidos no sobrenadante de cultura de bactéria e posteriormente purificados por cromatografia de afinidade utilizando colunas de níquel. Para a confirmação da atividade ligante a ácidos nucléicos, bem como para a caracterização de sua afinidade e especificidade, essas proteínas foram submetidas à imunoensaios. A afinidade foi testada tanto por ELISA de ligação direta, onde o único antígeno utilizado era o Oligo dTbiotina, quanto por ELISA de competição. Neste último tipo de imunoensaio foram utilizados diversos ssDNA solúveis como competidores: Oligo dT, Oligo dA, Oligo dC, Oligo dG, Oligo dU. Além disso, dois desses scFvs foram testados quanto à capacidade de inibição da ligação a Oligo-dT pelo antígeno originalmente utilizado (FITC) para a imunização dos animais. As análises realizadas nesse trabalho mostram que os scFvs são capazes de se ligar ao antígeno utilizado na seleção da biblioteca. Além disso, existe uma dependência da composição das CDRs e a capacidade de reconhecimento dos Ac recombinantes de diferentes seqüências de DNA fita simples. Nesse sentido, um dos scFvs caracterizados apresentou uma grande polirreatividade, ligando-se a diferentes antígenos, enquanto que os outros três apresentaram ligação significativa apenas a Oligo-dT e a Oligo-dA, dentre os oligonucleotídeos testados. Também é de tamanha relevância o achado de que mesmo tendo sido obtidos a partir de uma seleção por afinidade a Oligo-dT, a ligação ao antígeno utilizado para a imunização dos animais (FITC) é mantida para os dois fragmentos de Ac testados. Todos esses dados sugerem que a afinidade e a especificidade desses fragmentos de anticorpos dependem não só da interação deste com o esqueleto de açúcar-fosfato, mas também com as bases nitrogenadas. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Anti-DNA antibodies are commonly found in autoimmune disease patient sera. Several studies are made trying to understand their origin and the basis of their affinity. We had previously constructed a scFv library from BSA-fluorescein chicken immunized Ab repertoire and used it to select anti-ssDNA antibodies. Several clones were analyzed in terms of scFv production and VH and VL sequences, and among them, four representatives ones were chosen for further characterization. The aim of this work was to produce and characterize the selected scFvs in terms of theirs immunological features, comparing their specificities. The recombinant scFvs were produced in bacterial culture supernatants and were purified using metal affinity chromatography. The purified proteins were tested by ELISA immunoassays for ssDNA direct binding. The purified scFvs were also tested by ELISA immunoassays for ssDNA competition using soluble ssDNA: Oligo-dA, Oligo-dC, Oligo-dG, Oligo-dT, Oligo-dU. We also tested the remaining binding to FITC. The protein production and purification yielded enough recombinant products for immunological characterization. The recombinant affinity-purified products were able to bind to Oligo(dT)-biotin and this association was inhibited by Oligo-dT itself, Olig-dA and Oligo-dU. Also, for the two tested scFvs, FITC was able to compete with Oligo-dT-biotin binding. Although quite similar to the other scFvs, one of the characterized proteins showed a strong polyreactivity. These data showed that we were able to select specific antibodies fragments anti-ssDNA from a nonimmune source. The antibodies produced in bacterial cells relied their binding activity not only on sugar-phosphate backbone, but also on nitrogenous base recognition.