Análise proteômica aplicada à ontogenia, comportamento e aprendizagem em abelhas

Abstract

A abelha da espécie Apis mellifera é um inseto social que apresenta comportamentos complexos e integrados. As mudanças no comportamento ocorrem a partir da diferenciação ontogenética e comportamental de nutridora para campeira. Neste trabalho, proteomas do cérebro das abelhas nutridora e campeira foram comparados através de eletroforese bidimensional em gel dentro da faixa de pH de 4-7 e análise por MudPIT, a fim de encontrar proteínas relacionadas ao desenvolvimento ontogenético e comportamental. Vinte proteínas diferencialmente expressas foram detectadas por análise computacional das imagens dos géis e identificadas por PMF utilizando espectrometria de massas MALDI-TOF. O cérebro de nutridora apresentou alta expressão das proteínas principais da geléia real (MRJP1, MRJP2 e MRJP7), que estão relacionadas com a determinação de castas e funções sociais durante a diferenciação das larvas. Análise por imunocitoquímica e microscopia eletrônica revelaram MRJP1 no citoplasma de células cerebrais, aparentemente ao longo de filamentos do citoesqueleto, nos lobo antenal, lobo óptico e corpos cogumelares. MRJP1 também foi encontrada em espaços intercelulares entre células dos corpos cogumelares, indicando que é uma proteína secretada. Outras proteínas implicadas na síntese protéica e funções putativas no sistema olfativo também foram mais expressas em cérebro de nutridora. Em campeiras experientes foram mais expressas proteínas envolvidas no metabolismo energético, transportes de ferro e metabolismo de neurotransmissores. Expandindo-se a análise proteômica pela estratégia de MudPIT, o primeiro mapeamento em grande escala do proteoma cerebral da abelha operária da espécie A. mellifera foi alcançado. Identificou-se um total de 2.742 proteínas a partir de amostra de cérebros de abelha operárias, nutridora e campeira, sendo que 17% das proteínas totais foram encontradas como diferencialmente expressas por amostragem estatística de contagem espectral e teste-G. A nutridora apresentou expressão aumentada no cérebro de proteínas envolvidas na tradução, estrutura ribossomal e biogênese (14,5%), consideravelmente maior que a operaria campeira (1,8%). Em campeiras as proteínas envolvidas na produção e conversão de energia foram muito abundantes, mostrando ampla diferença neste conjunto de proteínas (17%) em relação à operaria nutridora (0,6%). Ambas as metodologias foram coincidentes nos resultados de categorização e expressão diferencial de nove proteínas. Em experimentos relacionados à aprendizagem operante, foram comparados mapas proteômicos e fosfoproteômicos por 2-DE de extratos cerebrais da abelha mandaçaia (Melípona quadrifasciata), identificando-se uma isoforma da proteína arginina quinase como mais expressa no cérebro das abelhas treinadas por condicionamento operante. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT

The honey bee (Apis mellifera) is a social insect that shows complex and integrated behaviors. For instance, A. mellifera behavior changes upon the ontogenetic differentiation from nurse to forager worker subcastes. In this work, brain proteomes of nurses and foragers were compared by two-dimensional gel electrophoresis (2DE) within pH range of 47 and MudPIT analysis in order to find proteins related to such a ontogenetic and behavioral development. Twenty differentially expressed proteins were detected by gel image computational analysis, and identified by peptide mass fingerprinting using MALDI-TOF mass spectrometry. Nurse brain showed increased expression of major royal jelly proteins (MRJP1, MRJP2 and MRJP7), which are related to determination of castes during the honey bee larvae differentiation. Immunocytochemistry and electron microscopy showed that MRJP1 was localized in the cytoplasm of brain cells, seemingly along filaments of the cytoskeleton, in the antennal lobe, optical lobe and mushroom body. MRJP1 was also found in intercellular spaces between cells in mushrooms bodies, indicating that it is a secreted protein. Other proteins implicated in protein synthesis and putative functions in the olfactory system were also up-regulated in the nurse brain. Experienced foragers overexpressed proteins possibly involved in energy production, iron binding, metabolic signalling and neurotransmitter metabolism. As an expansion of the proteomics analysis, large-scale mapping of worker honey bee brain proteome was achieved by MudPIT analysis. An excess of 2742 proteins were identified from forager and nurse honey bee brain samples, with 17% of total proteins found to be differentially expressed by spectral count sampling statistics and G-test. Nurse brain showed increased expression of proteins implicated in translation, ribosomal structure and biogenesis (14.5 %), in comparison with forager (1.8%). Experienced foragers overexpressed proteins involved in energy production and conversion, showing extensive difference in this set of proteins (17 %) in relation to nurse subcaste (0.6%). Both methodologies (MudPIT and 2DE) provided coincident results of categorization and differential expression of nine proteins. Regarding operant learning experiments, proteomic and phosphoproteomic 2- DE maps of brain extracts from mandaçaia bee (Melipona quadrifasciata) were compared. A single isoform of arginine kinase was identified as over expressed in the brain of bees trained by operant conditioning.