Xanthomonas euvesicatoria pv. allii : variabilidade e desenvolvimento de método de detecção por PCR

Abstract

A cebola (Allium cepa L.) é uma importante hortaliça cultivada desde a antiguidade e distribuída mundialmente. É a terceira hortaliça mais cultivada no mundo. Desde 2018 tem sido observado um aumento na ocorrência de queima bacteriana em campos de cultivo de cebola nos estados de Goiás, Minas Gerais e Distrito Federal, ameaçando a qualidade e a produtividade da cebola no Cerrado brasileiro. Foram coletadas amostras sintomáticas de folhas e os isolados bacterianos obtidos pertencente à coleção de Bactérias Fitopatogênicas de Hortaliças da Embrapa Hortaliças, utilizados para ampliar os conhecimentos sobre o patógeno. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi identificar e caracterizar os isolados coletados em 2021 e desenvolver um novo método de detecção por PCR para Xanthomonas euvesicatoria pv. allii (Xea). Os isolados tiveram seu gênero confirmado como Xanthomonas pela amplificação do gene gumD e a variabilidade intraespecífica analisada por BOX-PCR. Haplótipos definidos por BOX-PCR foram selecionados para o sequenciamento de quatro regiões genômicas para Multilocus sequence analysis (MLSA). Para o desenvolvimento de um novo método de detecção, os seis genomas de Xea, disponíveis no GenBank foram reanotados, e por subtração in silico, buscou-se genes presentes entre todos os isolados e ausentes para demais espécies e patovares de Xanthomonas. Para o desenho de primers, as sequências dos genes exclusivos foram usadas no software NEB LAMP Primer Design Tool. Os primers sintetizados foram avaliados quanto à amplificação de todos os isolados de Xea, sensibilidade e especificidade com microbiota isolada de folha de cebola. Todos os isolados de cebola pertenciam ao gênero Xanthomonas e por BOX-PCR foi possível identificar a presença de quatro haplótipos na coleção de 2021 além dos oito haplótipos definidos em trabalho prévio com isolados dos anos 2018/2019. MLSA revelou o pertencimento dos isolados a Xea, os isolados de 2021 agruparam aos de 2018/2019, com elevados valores de probabilidade posterior, porém o isolado A-2021- 01 agrupou em um clado mais distante, com isolados da patovar alfalfae. Somente o par de primers 5038_ID9 amplificou somente o fragmento esperado de 200 pb, com sensibilidade de amplificação de concentrações iguais ou superiores à 50 pg DNA. Especificidade foi confirmada pela ausência de amplificação com DNA de oito isolados da microbiota de folhas de cebola.