Evolução in vitro de anticorpos anti-CD3 pela seleção de cadeias leve (VL) humanas por phage display

Abstract

Nos últimos 20 anos a utilização de anticorpos monoclonais (mAbs) para fins terapêuticos vêm revolucionando o tratamento de diversas enfermidades. Desde a aprovação pelo FDA (Food and Drug Administration USA), em 1986, do anticorpo murino anti-CD3, Orthoclone OKT3 o mercado de anticorpos monoclonais vem crescendo a passos largos. Esse trabalho teve como objetivo o melhoramento do anticorpo OKT3 humanizado utilizando a técnica de domain shuffling. Para tanto scFvs contendo a região codante da cadeia variável pesada humanizada foram obtidos variando-se os genes de cadeias leves, clonadas a partir de uma biblioteca humana. Esses scFvs foram produzidos na forma de partículas virais de fusão para serem utilizados em procedimentos de seleção de acordo com a técnica de phage display. Para dar início a seleção de partículas virais ligantes, foi necessária a expressão e purificação do antígeno CD3 recombinante em E. coli. Esse antígeno foi expresso na fração citoplasmática solúvel de células da linhagem BL21. Foi realizada a purificação e constatou-se a manutenção das características antigênicas do CD3 por imunoensaio com anticorpos anti-CD3 comerciais ou recombinantes. Em seguida, averiguou-se se os fagos selecionados eram capazes de se ligar ao antígeno e a quais ciclos de seleção eles pertenciam. Concluiu-se com o presente trabalho que o procedimento de seleção de anticorpos na forma de scFv pela estratégia de shuffling de cadeia aliada à técnica de Phage Display foi eficaz em selecionar clones com capacidade de ligação ao antígeno recombinante. Esse trabalho aponta para a validação dos anticorpos obtidos em comparação com os anticorpos comerciais (OKT3 e UCHT). _______________________________________________________________________________ ABSTRACT

In the last 20 years the use of monoclonal antibodies (mAbs) for therapeutic purposes are revolutionizing the treatment of various diseases. Since the approval by the FDA (Food and Drug Administration - USA) in 1986, the murine anti-CD3 antibody, Orthoclone OKT3, monoclonal antibodies market is scaling up. This work aimed the improvement of a humanized OKT3 antibody using the technique of domain shuffling. The strategy chosen was keeping constant the anti-CD3 humanized heavy chain coding region combined with light chains genes, cloned from a human Fab library. These scFvs were fused to filamentous phage gene protein III. These fusion virions were used in selection procedures as stated by Phage Display technique. To proceed the selection we first expressed and purificated the CD3 recombinant antigen in E. coli. This antigen was recovered from the soluble cytoplasmatic fraction of E. coli strain BL21cells. Purification was carried out by metal affinity chromatography, and the recombinant protein antigenic features were assessed by immunoassay using comercial or recombinant anti-CD3 antibodies. The selection procedure was performed in four selection rounds, and the selected phages were screened by their ability of antigen recognition. The bound phages were found predominantly among those from round four (86 % of the assayed phage clones). In conclusion, this work was able to select new anti-CD3 antibodies and these new molecules must now be further charicterized to validate them in comparison with commercial antibodies (OKT3 and UCHT) and as a second generation of biopharmaceuticals.