Clonagem, expressão heteróloga e caracterização funcional de uma endoglicanase de Penicillium echinulatum

Abstract

Neste trabalho foram realizados estudos pioneiros de Biologia Molecular com o fungo Penicillium echinulatum linhagem 9A02S1 (DSM 18942), que resultaram no primeiro isolamento e caracterização de um cDNA correspondente ao gene egl1, codificador da endoglicanase 1 (EGL1). O cDNA egl1 foi obtido a partir de uma biblioteca construída sob condições de indução do sistema celulolitico deste fungo. Sua sequência, de 1161 pares de bases, exibe alto grau de identidade com genes de endoglicanases fúngicas da família 5A. Este codifica uma proteína predita de 387 resíduos de aminoácidos, com massa molecular de 41,1 kDa, ponto isoelétrico teórico de 4,99 e um sitio potencial de N glicosilação. A proteína predita possui três diferentes domínios: um domínio catalítico, um domínio de ligação à celulose (CBD) altamente conservado, e uma região de conexão entre os dois domínios (hinge). A partir da seqüência predita de aminoácidos de EGL1 foi possível realizar a modelagem tridimensional, utilizando-se proteínas existentes em banco de dados (PDB). Tal proteína apresenta propriedades estruturais similares às endoglicanases da família 5A. O cDNA egl1 foi clonado em um vetor de expressão de Pichia pastoris, pPIC9. Após a transformação, clones recombinantes exibindo maior atividade enzimática foram selecionados, utilizando-se micro-fermentações em placa Deep Well. Após a seleção do melhor clone produtor, foram avaliadas as propriedades bioquímicas da enzima recombinante, bem como a otimização das condições de cultivo e posterior caracterização de sua cinética enzimática. A enzima recombinante expressa em P. pastoris apresenta características de particular interesse para a utilização em processos indústriais: uma atividade ótima na faixa de pH 5,0 – 9,0, temperatura ótima a 60°C, exibindo alta termoestabilidade a 70°C após uma hora de pré-incubação, sendo a atividade da EGL1 recombinante fortemente estimulada pela adição do íon cálcio na reação. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT

This work describes the pioneering molecular biology studies with the fungus Penicillium echinulatum lineage 9A02S1 (DSM 18942), which resulted in the first isolation and characterization of a cDNA corresponding to an egl1 gene, encoding a endoglucanase 1 (EGL1). The egl1 cDNA was obtained from a library constructed under induction conditions of the cellulolytic system of this fungus. The cDNA sequence is 1,161 base pairs long, showing high identity scores with genes of fungal endoglicanases family 5A. It encodes a predicted protein of 387 amino acid residues, with molecular mass of 41.1 kDa, theoretical isoelectric point of 4.99 and a potential site of N-glycosylation. The predicted protein has three different domains: a catalytic domain, a highly conserved carbohydrate binding domain (CBD), and a region linking the two domains (hinge). From the predicted amino acid sequence of EGL1 it was possible to perform a three-dimensional modeli, using protein sequences deposited in data bank (PDB). The solved structure revealed that this protein displays structural properties similar to those observed in family 5A endoglucanases. The egl1 cDNA was cloned in a Pichia pastoris expression vector, pPIC9. Following transformation, recombinant clones with higher enzymatic activity were selected, using microfermentations in Deep Well plates. After selecting the best producer clone, we evaluated the biochemical properties of recombinant enzyme, as well as the optimization of culture conditions and subsequent characterization of the enzyme kinetics. The recombinant EGL1 secreted by the recombinant P. pastoris revealed characteristics of particular interest for industrial applications: an optimal activity over a broad range pH (5.0 – 9.0) and an optimal temperature of 60°C. The recombinant EGL1 showed high thermostability at 70°C after 1 h of pre-incubation, and the activity of recombinant EGL1 was strongly stimulated by the addition of calcium ion in the reaction.