Desenvolvimento de processos para produção em escala da enzima L - Asparaginase Por Escherichia coli BL21 (DE3) AspB

Abstract

A enzima L-asparaginase (L-ASNase) catalisa a hidrólise do aminoácido asparagina em ácido aspártico e amônio. Devido ao seu mecanismo de ação, esta enzima é utiliza no tratamento da leucemia linfocítica aguda, pois quando a L-ASNase é administrada no plasma sanguíneo causa o esgotamento do aminoácido resultando na apoptose seletiva das células cancerígenas. A enzima L-asparaginase não é produzida no Brasil, devido ao desabastecimento ocorrido em 2013 no mercado brasileiro desta enzima viu-se a necessidade de uma produção nacional da L-ASNase. Buscando alternativas viáveis de produção desta enzima, este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de processos para a produção em escala da enzima L-ASNase pela bactéria Escherichia coli BL21 (DE3) AspB. Para a quantificação da enzima L-ASNase foram comparados os métodos de Nessler e o método de β-hidroxamato aspártico (AHA), sendo escolhido o AHA devido sua baixa interferência com a amônia livre. Foram testados três meios de cultivo, o meio definido, o meio semi-definido e o meio complexo. O meio definido foi o que obteve menor custo de produção e a maior atividade de L-ASNase. Para a fase de produção da enzima, dois indutores foram comparados, a lactose e seu análogo IPTG. Das concentrações testadas para os indutores as que obtiveram a maior atividade da enzima foi de 10 g L-1 para a lactose e 0,45 mmol L-1 para o IPTG. O momento da curva de crescimento que obteve a maior atividade da L-ASNase para o início da indução foi no meio da fase exponencial. A atividade da L-ASNase foi acompanhada durante o intervalo de 10-24h, nos tempos 18 e 20h não houve diferença estatísticas entre os indutores. A lactose foi escolhida como indutor para a continuidade dos experimentos devido a semelhança entre as atividades da L-ASNase com ambos os indutores, baixa toxicidade e baixo custo. Nos estudos em biorreator, foram feitos cultivos em batelada e batelada alimentada tendo como objetivo a alta densidade celular para depois iniciar a indução do cultivo. Os cultivos de batelada alimentada o peso seco final foi de 69,90 g L-1 . A produção da enzima L-ASNase em batelada alimentada induzida com 30 g L-1 a que apresentou a melhor produção da enzima com 43.954,79 U L-1. A produção da enzima L-ASNase foi realizada com sucesso em agitador orbital e biorreator, trazendo avanços para a produção de uma enzima L-ASNase nacional que seja viável economicamente.