Funcionalidade de serina integrases no controle de interruptores genéticos em plantas

Abstract

A biologia sintética tem sido caracterizada por abordagens interdisciplinares voltadas para o desenho e/ou reprogramação de sistemas biológicos. Fomenta a síntese de genomas completos ou reduzidos e o desenvolvimento de novas tecnologias de edição e de controle de expressão de genes que permitam o implemento de características desejadas. Desse contexto têm emergido os circuitos genéticos biológicos sintéticos que, baseados na álgebra binária dos circuitos eletrônicos, colocam partes genéticas sob um controle de entrada e saída (input-output) para a geração de interruptores (switches), portas lógicas e redes genéticas sintéticas. Um elemento chave para tais circuitos são as enzimas recombinases do grupo das serina integrases, que são capazes de reconhecer sítios attB/attP e inverter a sequência de DNA inserida entre eles de forma unidirecional. Assim, essas enzimas podem ser utilizadas como ferramentas para ativar e desativar a expressão gênica a partir da inversão de partes biológicas, como promotores, terminadores ou sequências codificadoras. Contudo, o número dessas proteínas completamente caracterizadas para aplicações em plantas é ainda reduzido. É, portanto, de interesse o incremento do número de integrases funcionais para permitir a construção de circuitos genéticos vegetais voltados para a aquisição de múltiplas características vantajosas. Desta forma, o objetivo deste estudo foi avaliar a funcionalidade de seis serina integrases (2, 4, 5, 7, 9 e 13) na ativação de interruptores genéticos unidirecionais em protoplastos de Arabidopsis thaliana. A construção dos interruptores envolveu desenho e síntese de um sistema de plasmídeos repórteres e plasmídeos para expressão das integrases. Os repórteres possuem a sequência codificadora do gene gfp ou a sequência promotora CaMV 35S invertidas e flanqueadas pelo sítio de reconhecimento das integrases. A saída do sistema é a fluorescência da proteína GFP. Ensaios baseados em cotransformação transiente foram realizados para validar a capacidade das serina integrases ativarem os interruptores pela inversão das partes genéticas. As células fluorescentes positivas resultantes foram avaliadas por microscopia e por citometria de fluxo. Para ativação da sequência codificadora de gfp, as integrases 13, 9 e 4 promoveram as maiores proporções de células GFP positivas. As já estabelecidas phiC31 e Bxb1, e a integrase 7 promoveram proporção intermediária e a integrase 2, baixa. Sob ação da integrase 5, não foi observada fluorescência. Para ativação do promotor, as integrases 2 e 4 levaram às maiores porcentagens de células com o repórter GFP. Análise molecular por PCR indicou que todas as integrases rotacionaram as partes genéticas, mesmo a integrase 5, que não apresentou resultado de ativação por medição da fluorescência do GFP. Análises por sequenciamento evidenciaram a formação dos sítios resultantes da recombinação, attL/attR, e a correta orientação do promotor e da sequência codificadora do gfp para todas as integrases. Ensaio de viabilidade celular mostrou que as integrases não têm atividade citotóxica. Os resultados obtidos demonstraram a funcionalidade das integrases testadas em um sistema de interruptor vegetal e podem embasar o desenvolvimento de circuitos genéticos sintéticos mais finamente regulados para controlar a expressão gênica em plantas.