Viroma de plantas em áreas nativas e cultivadas do Distrito Federal

Abstract

O Brasil possui grande parte do seu território ocupado por vegetação nativa e áreas plantadas com espécies florestais. Nos últimos anos, a ação antrópica caracterizada pela expansão da agricultura e pecuária alteraram esse cenário de maneira significativa. A introdução de práticas que modificam o uso da terra pode influenciar na microbiota presente em ambientes naturais, de transição e agrícola. A região central do Brasil, predominantemente inserida no bioma Cerrado, é um polo de produção agrícola, onde as muitas áreas nativas foram substituídas por culturas extensivas. Pouco ainda se sabe sobre a diversidade viral presente nas espécies arbóreas nativas desse bioma. Eventos geradores de variabilidade em vírus de plantas podem propiciar a adaptação a novos ambientes e surgimento de novas espécies bem como facilitar de dispersão por artrópodes. Neste contexto, a expansão de fronteiras agrícolas pode favorecer o fluxo/trânsito de vírus entre os diferentes ambientes. Avanços nas tecnologias de sequenciamento e análise metagenômica têm permitido a detecção e caracterização molecular de um número crescente de espécies virais. Assim, o objetivo deste trabalho foi prospectar a distribuição de vírus associados a espécies arbóreas e cultivadas em diferentes microambientes da área de Cerrado de Brasília-DF (Distrito Federal), no Brasil Central. Ao todo, 296 amostras foliares (134 espécies e 49 famílias botânicas) foram obtidas em áreas de três microambientes: (a) Áreas antrópicas (n=176); (b) Áreas de conservação (n=60) e (c) Áreas de transição (n=60). As extrações de DNA foram realizadas individualmente e seguidas de enriquecimento via círculo rolante (RCA). As amostras foram agrupadas em cinco conjuntos e sequenciadas em uma plataforma Illumina Hiseq2500. Os resultados do High-Throughput Sequencing (HTS) geraram um total de 167.689,52 leituras formando 297.103 contigs, dos quais 503 mostraram identidade com vírus vegetais em análises com o algoritmo BLASTx. Foram recuperados 30 contigs (= 24 espécies virais), permitindo a identificação de 12 novas espécies das famílias: Geminiviridae (01), Genomoviridae (04), Circoviridae (04) bem como vírus de ssDNA sem classificação (03). Dezoito contigs (= 12 espécies virais já descritas) foram caracterizados nas famílias: Geminiviridae (08), Genomoviridae (02) e Caulimoviridae (02). O resultado de HTS foi validado empregando primers específicos que foram utilizados para detecção e/ou recuperação do genoma completo (obtido mediante sequenciamento via Sanger). Foi observada uma prevalência de vírus em áreas de ambiente antrópico (com especial destaque para membros da família Geminiviridae). Poucos vírus foram detectados nas áreas de ambiente de conservação. No ambiente de conservação, as detecções foram de vírus classificados na família Genomoviridae. No ambiente de transição, observou-se que algumas espécies que ocorrem sob condições de cultivo também estão ocorrendo em espécies arbóreas. Espécies botânicas classificadas nas famílias Solanaceae e Fabaceae apresentaram o maior número de espécies

de vírus. Seis contigs que apresentaram identidade com representantes da família Genomoviridae foram caracterizados molecularmente. Destes, quatro correspondiam a novas espécies e dois a espécies já conhecidas. Além disto, dois isolados de Cauliflower mosaic virus (Caulimovirus, Caulimoviridae) foram detectados em couve e em uma nova hospedeira – Fevillea trilobata. Foi também possível detectar uma nova espécie de ssDNA (até o momento sem classificação em gênero e família) em Caesalpinia pluviosa. Além disso, sequências do genoma completo de sete espécies virais foram recuperadas por HTS: Sugarcane baciliforme virus – SBCV (Badnavirus, Caulimoviridae), duas novas espécies de ssDNA (sem classificação) e quatro novas espécies de Circoviridae. (Capítulo 2). Foi acrescentada uma nova espécie da família Genomoviridae em Eucalyptus urophylla, totalizando sete espécies. Foram identificadas sequências de três espécies através de análises de identidade pareada e filogenia que ficaram próximas a uma espécie do gênero Gemyvongvirus detectadas em Vochysia rufa, Byrsonima crassiflora e E. urophylla, para as quais foram propostos os nomes Vochysia rufa associated genomovirus – VoaGmV, Byrsonima crassiflora associated genomovirus e Eucalyptus urophylla associated genomovirus, respectivamente. Sequências de duas novas espécies virais foram detectadas: Tecoma stans associated gemykolovirus (Gemykolovirus) em Tecoma stans e Ouratea duparquetiana associated gemykibivirus (Gemykibivirus) em Ouratea duparquetiana. Além disto, foram detectados dois isolados das espécies Gila monster-associated gemykrogvirus - (Gemykrogvirus) em Trembleya parviflora e Momordica charantia associated gemycircularvirus (Gemycircularvirus) em berinjela (Capítulo 3). Treze contigs apresentaram identidade com sequências de nove espécies da família Geminiviridae. Isolados das nove espécies virais foram considerados como: (1) Nova espécie: Macroptilium bright yellow interveinal virus – MaBYIV (Begomovirus) detectada em Macroptilium erythroloma em infecção mista com isolado de Bean golden mosaic virus – BGMV (Begomovirus). Ensaios de transmissão via mosca-branca (Bemisia tabaci MEAM 1) foram conduzidos usando como fonte de inóculo M. erythroloma para cultivares de feijão, caupi, amendoim, soja e tomate. A transmissão de MaBYIV ocorreu para plantas de feijão e soja. BGMV foi transmitido para todas as plantas. (2) Isolados de duas espécies da família Geminiviridae sem relato no país e/ou com sequência divergente: primeiro relato no país de um isolado de Tomato apical leaf curl virus – ToALCV proveniente do tomateiro e registro de dois isolados divergentes de Tomato associated geminivirus 1 – TaGV1 no tomateiro e em uma nova hospedeira (beterraba). Clones de ToALCV e TaGV1 foram inoculados via biobalística nas hospedeiras originais e em Nicotiana benthamiana. Somente o isolado de TaGV1 foi capaz de causar infecção e replicar-se em N. benthamiana. (3) Isolados de quatro espécies virais já conhecidas detectados em novas hospedeiras: dois isolados de Maize striate mosaic virus – MSMV (Mastrevirus) em cana de açúcar (Saccharum officinarum); novos isolados de BGMV em berinjela, angico (Anadenanthera colubrina) e macroptilium; um isolado de Tomato severe rugose virus (Begomovirus) em algodão (Gossypium hirsutum) e dois isolados de Tomato mottle leaf curl virus (Begomovirus) em leiteiro (Euphorbia heterophylla) e o outro em Ouratea duparquetiana. (4) Isolados de cinco espécies (gênero Begomovirus) em hospedeiras já conhecidas: vinte e quatro isolados de ToSRV, sendo em tomate (11), berinjela (11) Nicandra

physalodes (1) e Sida sp. (1); três isolados de ToMoLCV em tomate; sete isolados de BGMV em feijão; quatro isolados de Sida micrantha mosaic virus (Begomovirus) em algodão (2), guanxuma

(1) e N. physalodes (1) e quatro isolados de Sweet potato leaf curl virus (Begomovirus) em batata- doce e (5) Isolados de Mastrevirus em hospedeira já descrita: dois isolados de MSMV foram

recuperados de milho (Capítulo 4). Os resultados do presente trabalho indicam uma considerável diversidade viral em espécies arbóreas, cultivadas e daninhas. HTS e metagenômica foram importantes ferramentas no estudo e caracterização da diversidade viral em diferentes ambientes naturais e antrópicos.