Análise funcional e da diversidade de um consórcio microbiano capaz de degradar lignina

Abstract

Dentro de um modelo de biorrefinarias, o melhor aproveitamento da biomassa lignocelulósica requer a degradação da lignina e o seu uso como matéria-prima na geração de bioprodutos. A lignina é a maior fonte de compostos fenólicos na natureza. A recalcitrância à conversão enzimática ainda é uma das etapas limitantes no processo de valorização da lignina. Na natureza, fungos e bactérias conseguiram driblar a recalcitrância da lignina e são capazes de degradá-la por meio de enzimas oxirredutases. No primeiro capítulo dessa dissertação, foi analisada a diversidade microbiana de quatro consórcios enriquecidos para microrganismos capazes de degradar lignina. Os consórcios foram obtidos a partir de solo comercial, cultivados a 30 ºC e 37 ºC e enriquecidos por meio de sucessivas passagens em meio de cultura onde lignina Kraft ou lignina extraída por método alcalino foi usada como fonte de carbono. Foi realizado o sequenciamento de iTags da região espaçadora transcrita interna ITS de fungos, e da região ribossomal 16S de bactérias, para cada um dos seis ciclos de adaptação (passagens). A análise da comunidade microbiana mostrou que a diversidade diminuiu gradualmente e a comunidade tende a se estabilizar em termo de composição a partir da quarta passagem. As variáveis substrato e temperatura atuam na modificação da composição de famílias em cada consórcio. Diferentes famílias bacterianas que atuam na degradação da lignina foram identificadas: Planococcaceae, Paenibacillaceae e Bacillaceae do filo Firmicutes; Rhodobacteraceae, Sphingomonadaceae, Methylobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Brucellaceae, Burkholderiaceae, Phyllobacteriaceae e Erythrobacteraceae, do filo Protebacteria; Flavobacteriaceae do filo Bacteroidetes; e Microbacteriaceae do filo Actinobacteria. Espécies do filo Firmicutes e Proteobacteria foram favorecidas, respectivamente, pelo cultivo em lignina extraída por método alcalino e lignina Kraft. Para a comunidade fúngica, Trichosporonaceae, Trichocomaceae e Cephalothecaceae são as principais famílias encontradas ao final do processo de enriquecimento. Além disso, foram identificados ciliados que possivelmente desempenharam um papel importante na dinâmica evolutiva da comunidade microbiana. No segundo capítulo dessa dissertação, foi obtida uma biblioteca metagenômica, BElig MG 6P, com o DNA da sexta passagem do consórcio microbiano cultivado a 37 ºC e enriquecido com lignina extraída por método o alcalino. Os clones da biblioteca foram transformados em Escherichia coli HB101 e Pseudomonas putida KT2440. Duas abordagens foram utilizadas para triar essa biblioteca para clones que codifiquem enzimas ligninolíticas: uma metodologia funcional e outra baseada na sequência. A metodologia funcional é baseada no fenótipo das colônias que revelam atividades de enzimas ligninolíticas, sendo capazes de oxidarem os compostos aromáticos: guaiacol, catecol, 4-metilcatecol e ácido ferúlico ao longo de 24 horas. Sete potenciais clones positivos foram obtidos, mas apenas três foram sequenciados: P1 7A, P3 3G e P4 7G. ORFs de interesse foram obtidas por essa metodologia. Na metodologia baseada na sequência primers, previamente construídos a partir de domínios conservados de enzimas ligninolíticas já descritas, foram utilizados para amplificar fragmentos por reação em cadeia da polimerase (PCR), utilizando o DNA da biblioteca metagenômica BElig MG 6P como molde. Essa metodologia permitiu identificar uma lacase e uma metiltransferase, ambas de Escherichia coli. Uma metodologia adicional baseada na complementação da atividade em Pseudomonas putida KT2440 identificou potenciais clones positivos que convertem guaiacol em catecol permitindo que Pseudomonas putida KT2440 utilize o guaiacol como única fonte de carbono.