Crystal structures and biophysical studies of phytocystatins

Abstract

Fitocistatinas são inibidores de cisteíno-proteases encontrados em plantas, onde participam de vários processos fisiológicos, dos quais se destacam a deposição de proteínas de armazenamento, germinação de sementes e senescência de folhas. A expressão de fitocistatinas em plantas tem um papel importante na tolerância a fatores de estresse abióticos e resistência a herbivoria por insetos, o que torna essas proteínas valiosos alvos de estudo, devido a aplicações biotecnológicas no melhoramento de culturas. Neste trabalho, técnicas biofísicas foram empregadas para caracterizar fitocistatinas de organismos economicamente relevantes, como Hevea brasiliensis (seringueira), Theobroma cacao (cacaueiro), Humulus lupulus (lúpulo) e Cannabis sativa (cannabis). As proteínas foram obtidas por expressão heteróloga em E. coli Lemo21 (DE3), cultivadas em meio auto-indutor ZYM-5052, e purificadas por cromatografia de afinidade ao níquel (Ni2+) seguida de cromatografia de exclusão molecular S-75. A estabilidade térmica foi monitorada por dicroísmo circular em ensaios de desnaturação térmica em diferentes pHs, e a oligomerização das proteínas foi estudada por ultracentrifugação analítica. Screenings de cristalização das proteínas foram realizados com o robô mosquito®, as condições de cristalização foram refinadas manualmente e os cristais foram submetidos à coleta de dados de difração de raios-X no LNLS. Ensaios de desnaturação térmica mostraram que as proteínas apresentam elevadas temperaturas de desdobramento (Tm), indo de 61 °C a 84 °C, e ΔG25’s resultantes do desdobramento acima de 4 kcal/mol em todos os pHs estudados, indicando estabilidade térmica de moderada a alta. Nas condições experimentais (20°C e pH 7,6), conformações diméricas da maioria das proteínas foram favorecidas, embora monômeros e tetrâmeros também tenham sido observados. A estrutura cristalina de uma fitocistatina do lúpulo foi resolvida a partir de cristais dos grupos espaciais ortorrômbicos P 2 21 21 e C 2 2 21 a resoluções máximas de 1,80 Å e 1,68 Å, respectivamente, e a estrutura cristalina de uma fitocistatina da cannabis foi resolvida a 3,6 Å a partir de um cristal do grupo espacial hexagonal P 65 2 2. As três estruturas apresentaram dímeros domain-swapped, onde a principal diferença em relação à estrutura de fitocistatina de maior identidade depositada no PDB são o ângulo e a distância entre os lobos do dímero.