Caracterização biofísica de proteínas Vap do sistema toxina-antitoxina de Mycobacterium tuberculosis

Abstract

Estima-se cerca de 1,4 milhão de casos de óbito por tuberculose em 2015. Seu agente etiológico, Mycobacterium tuberculosis (Mtb), apresenta diversos mecanismos que propiciam a ocorrência de infecções reincidentes, dentre os quais destaca-se a persistência, que permite que algumas células apresentem um estado caracterizado por uma taxa metabólica muito baixa e tolerância a múltiplos antibióticos. A família de proteínas VapBC faz parte dos sistemas toxina-antitoxina e estão diretamente relacionadas a persistência. Quando em associação, a antitoxina (VapB) neutraliza a toxina (VapC). Fatores ambientais como stress celular podem levar a proteólise da antitoxina, o complexo (VapBC) é então desfeito possibilitando que a VapC exerça sua atividade tóxica de RNAse. Para o trabalho foram selecionadas algumas proteínas da família VapBC: VapB11, VapB17, VapB21, VapB38, VapC19 e VapC20. Os ensaios de expressão foram realizados em meio autoindutor ZYM-5052 utilizando células E. coli LEMO21, a 37 °C e variando o tempo de expressão entre 12 a 15 horas para as VapB, e a 20 °C por 7 horas de expressão para a VapC20. As proteínas foram purificadas por cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados (Ni2+), seguido por cromatografia de exclusão molecular. Ensaios de cristalização automatizados, utilizando as proteínas puras e kits de cristalização comercialmente disponíveis permitiu a observação de micro cristais para as proteínas VapB17, VapB38, VapC19 e VapC20, que seguiram para etapa de refinamento manual. Outros experimentos como ultracentrifugação analítica SDS-PAGE, PAGE-nativo e dicroísmo circular (DC) foram realizados para estas proteínas, a fim de elucidar características estruturais. A VapC19 apresentou um perfil oligomérico de dímero. Todas as VapB apresentaram duas populações oligoméricas: VapB38 (dímeros e tetrâmeros), VapB21 (dímeros e hexâmeros) e VapB11 (monômeros e dímeros). Análises de DC proveram Tm de 75 ºC para a VapB38 e 70 °C para a VapB17, além de informações estruturais sobre as antitoxinas.