Influência do ambiente post-mortem na expressão gênica e na degradação de RNAs cérebro de Mus musculus

Abstract

Na criminalística, em casos de homicídio, conhecer a hora precisa da morte é relevante para a inclusão e exclusão de suspeitos na dinâmica do crime. O intervalo entre esse acontecimento e a descoberta do corpo é chamado de intervalo post-mortem (IPM), correntemente inferido com a ajuda da tanatologia e da entomologia forense. É crescente o número de estudos que buscam indicadores de IPM utilizando parâmetros físicos, químicos e bioquímicos. O processo de morte dá início a degradação do corpo, tanto por vias intrínsecas quanto extrínsecas. Na extrínseca, sabe-se que o cadáver tem uma decomposição diferenciada de acordo com o ambiente no qual ele está exposto. Com relação a intrínseca, a degradação molecular leva à degradação de tecidos, sendo que os produtos gênicos envolvidos tanto já estão presentes antes da morte, como potencialmente podem ter sido transcritos após a morte. Ainda há a ativação de diversas vias metabólicas que levam a degradação dos ácidos nucleicos, incluindo o RNA. Considerando o conhecimento atual, a hipótese desse trabalho é que exista uma relação entre IPM tanto com a degradação e/ou transcrição de RNAs quanto com o repertório dessas moléculas em diferentes ambientes de ocultação de cadáver. Para tanto, o objetivo foi avaliar a degradação e possível transcrição de mRNA e miRNA em cérebro de camundongo (Mus musculus) em diferentes simulações de ocultação. Foram simulados três tipos de ocultação de cadáver: exposição ao ar, submersão em água e enterramento. Cérebros dos camundongos foram retirados em cinco IPM: 24, 48, 72, 96 e 192 horas. A avaliação da integridade das moléculas ao longo dos IPMs, mostrou a existência de RNAs íntegros em até 96 horas post-mortem. A busca de um biomarcador para a estimativa de IPMs e de distintas simulações de ocultação de cadáver foi realizada por análise de transcriptoma post-mortem (array de expressão) do controle, 0 horas, e dos três grupos experimentais no IPM de 48 horas. Foram encontrados 502 genes diferencialmente expressos, 222 comuns a todos os grupos de ocultação de cadáver. A partir disso escolheu-se buscar um biomarcador de IPM que não variasse entre os tipos de ocultação. Nessa busca, foi realizada uma análise de enriquecimento de vias metabólicas, o que levou à escolha final de oito transcritos para validação do Array de expressão, sendo F3 e Fabp7 os dois transcritos com maiores fold change, esses se mostraram potenciais biomarcadores. Foram estimadas regressões cúbicas para descrever a dinâmica de degradação desses transcritos ao longo do IPM. Além disso, foi observado que 27,23% dos genes diferencialmente expressos foram up-regulated, sugerindo transcrição post-mortem. Desses, a maioria está ligada a biogênese de ribossomos, manutenção celular e desenvolvimento, sendo um indicativo de resistência da célula ao processo de morte. Considerando que o array de expressão utilizado tinha baixa cobertura para miRNAs, foram analisados três miRNAs - miR-9, miR-124 e miR-134 -, descritos como específicos do cérebro, por RT-qPCR, visando avaliar a integridade dessas moléculas ao longo dos IPMs. Não foram encontradas diferenças tanto entre os IPMs testados como entre as simulações de ocultação de cadáver mostrando que esses miRNAs permanecem estáveis ao longo de ao menos 192 horas post-mortem. Conclui-se que exista uma relação na expressão e/ou degradação diferencial de mRNAs entre diferentes IPMs, porém uma estabilidade dos miRNA testados nesse mesmo intervalo post-mortem. Ainda, os ambientes simulados para ocultação de cadáver não interferem substancialmente no repertório dessas moléculas. Os dados aqui mostrados permitem inferir que seja possível estimar IPM utilizando mRNA, não sendo possível distinguir o ambiente de ocultação de cadáver considerando uma simulação com parâmetros controlados.