Produção do fator de crescimento epidermal humano (hEGF) em Komagataella phaffii

Abstract

O sistema de expressão baseado na utilização da levedura Komagataella phaffii tem sido utilizado com sucesso na produção de uma grande variedade de proteínas heterólogas. Esta levedura reúne características como fácil manipulação molecular, crescimento celular rápido, capacidade de realizar modificações pós-traducionais e secreção eficiente de proteínas, além de atingir altas densidades celulares com grande produção da proteína heteróloga. Uma das proteínas de grande interesse na indústria biofarmacêutica e cosmética é o fator de crescimento epidermal humano (hEGF). O objetivo desse estudo foi desenvolver um sistema para a produção de hEGF na levedura K. phaffii. Para isso foram utilizados os peptídeos sinais dos genes αF, SUC2 e PHO1. Três vetores foram construídos, cada um deles contendo um dos peptídeos sinal. Foram construídos os vetores de expressão sob o controle do promotor do PGK1 e utilizados para transformação de K. phaffii M12-K, uma linhagem mutante para o gene KEX1. Os clones recombinantes foram confirmados por PCR de colônia e foram crescidos em meio mínimo para avaliar a cinética de crescimento. Os clones positivos foram selecionados e utilizados na expressão em frasco empregando meio complexo. A presença do hEGF foi avaliada por SDS-PAGE e confirmada por Western blot na presença de um anticorpo específico. Com isso, um clone de cada sistema foi escolhido para a purificação do hEGF por cromatografia de exclusão molecular e RP-HPLC. A partir desses experimentos foi confirmada a presença do hEGF e o polipeptídeo foi parcialmente purificado. Finalmente, foi escolhido o clone 1αF para otimizar o processo de purificação, adicionando uma etapa em HILIC. O hEGF foi satisfatoriamente purificado. O tamanho correto e a sequência do N-terminal igual ao EGF presente em humanos foram confirmados por espectrometria de massas e sequenciamento automático. Os resultados obtidos mostram que o hEGF foi produzido com sucesso em K. phaffii com a sequência primária correta.