Análise proteômica da embriogênese somática e da aquisição de competência embriogênica de Ocotea catharinensis Mez. (Lauraceae)

Abstract

Ocotea catharinensis é uma espécie lenhosa florestal nativa da Mata Atlântica que possui grande importância econômica devida à sua madeira e à produção de óleos essenciais. Por causa de sua intensa exploração comercial e da baixa reprodução e viabilidade de suas sementes, O. catharinensis tornou-se ameaçada de extinção. O objetivo deste trabalho foi estudar a embriogênese somática de O. catharinensis por meio da análise proteômica comparativa dos diferentes estágios embriogênicos e também de agregados celulares cultivados em diferentes meios de cultura que produzem células com distintas competências embriogênicas. Para isso, os extratos de proteínas dos agregados celulares cultivados em diferentes meios (WPM, MS, MS+2,4 D) e dos embriões somáticos nos estágios globular (E1), cotiledonar inicial (E2), cotiledonar intermediário (E3) e embrião maduro (E4) foram submetidos à eletroforese bidimensional (2-DE). As amostras foram maceradas em N2 líquido e pó de vidro e precipitadas com solução de TCA/acetona seguida pela extração e solubilização em tampão 2-DE. A concentração de proteína foi determinada utilizando-se Plus One 2D QuantKit (GE Healthcare). As amostras foram submetidas à focalização isoelétrica utilizando-se géis de gradiente imobilizados de pH (IPG) na faixa de 4-7. Também foram realizados géis bidimensionais "dois-em-um" dos agregados celulares, nos quais os géis IPG com a mesma faixa de pH para duas diferentes amostras foram colocados lado-a-lado no topo de um gel para SDS PAGE vertical para a separação na segunda dimensão (Wang et al., 2003). Após a coloração com nitrato de prata, as imagens dos géis foram digitalizadas e submetidas à análises computacionais para se determinar o número e a intensidade dos spots, levando à informação da expressão diferencial de proteínas. Poucos spots mostraram mudanças de intensidade durante o desenvolvimento e nos meios de cultura testados. Estes spots foram analisados por espectrometria de massa utilizando-se espectrômetros de massa tipo MALDI TOF e nano-LC MS/MS (LTQ Orbitrap). Somente um spot foi identificado por MALDI-TOF e oito por LTQ Orbitrap. Entre os diferentes polipeptídeos identificados estão proteínas estruturais como a actina, proteínas antioxidantes como tiorredoxina, superóxido dismutase e outras como proteínas da família 14-3-3, germina e enzima biossintética de tiamina. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT

Ocotea catharinensis is a forest tree species from Mata Atlântica that has economic importance due to its wood and essential oils. O. catharinensis became an endangered species mostly because of its intense exploitation and its low seed production and viability. The objective of this work was to study O. catharinensis somatic embryogenesis through the comparative proteome analysis of different embryogenic stages as well as cell aggregates maintained in different culture media that produce distinct cell embryogenic competence. For that, the protein extracts of cell aggregates (calus) cultured in different medias (WPM, MS, MS+2,4-D) and of the somatic embryos in globular (E1), initial cotiledonary (E2), intermediary cotiledonary (E3) and mature embryo (E4) stages were subjected to two-dimensional gel electrophoresis (2-DE). The samples were ground in liquid N2 and glass powder, and the proteins precipitated with TCA/acetone solution followed by extraction and solubilization in 2-DE buffer. The protein concentration was determined using Plus One 2D QuantKit (GE Healthcare). The samples were submitted to isoelectric focusing using pH 4-7 immobilized pH gradient (IPG) strips. We also carried out “two-inone” gels (Wang et al., 2003) of cell aggregates, where IPG strips with the same pH range for two different samples were loaded side by side on top of a vertical SDS-PAGE gel for separation in the second dimension. After silver staining, the gel images were digitalized and subjected to computational analyses in order to determine the number and intensity of the spots, allowing the determination of protein differential expression. Few protein spots showed different intensities during the development and in the different culture media tested. These spots were analyzed by mass spectrometry using MALDI-TOF and nano-LC MS/MS (LTQ Orbitrap). Just one spot were identified by MALDITOF and eight by LTQ-Orbitrap. Among the identified polypeptides, there were structural proteins like actin, antioxidant proteins like tioredoxin, superoxide dismutase and others like the 14-3-3 family, germin and thiamine biosynthetic enzyme.