Expressão de proteínas do vírus da Dengue em células de inseto utilizando o Sistema Baculovírus de Expressão

Abstract

A Dengue é a doença humana transmitida por mosquitos mais comum que pode evoluir para um doença potencialmente letal denominada de febre hemorrágica do dengue (FHD). Essa doença é causada por um vírus de RNA fita simples, senso positivo e envelopado que pertence ao gênero Flavivirus, onde o genoma é organizado em uma única fase aberta de leitura (ORF), que codifica três proteínas estruturais (capsídeo, pré- M e envelope) e sete proteínas não-estruturais (NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5). Entre as proteínas virais, a proteína do envelope é uma das mais antigênicas e a proteína NS1 está relacionada com a lise de células infectadas, mediada pelo sistema complemento. Diferentes sistemas de expressão podem ser usados para a expressão de antígenos virais para o desenvolvimento de vacinas e/ou diagnóstico. Entre estes sistemas, o sistema de expressão baseado em baculovírus (BEV) é um dos mais populares e eficientes. Baculovírus infectam artrópodes, principalmente insetos e possuem um genoma de DNA circular, dupla fita. Existem muitas vantagens do BEV em relação a outros sistemas de expressão, como, por exemplo, o alto nível de expressão e as modificações pós-traducionais que permitem a montagem correta e atividade biológica da proteína expressa. Um isolado brasileiro de Dengue virus 1 foi usado para amplificar o gene do envelope ou o gene do envelope fusionado ao gene NS1 por RT-PCR, usando oligonucleotídeos específicos e os fragmentos obtidos foram clonados no vetor de transferência comercial pFastBac1 (Invitrogen). Esse plasmídeo possui regiões sítio-específicas que permitam a transposição do inserto de interesse dentro do genoma de um baculovírus (bacmídeo) propagado em Escherichia coli. O bacmídeo recombinante é usado para a expressão da proteína heteróloga em células de inseto infectadas. Dois vírus recombinantes foram obtidos, vAcDE e vAcDENS1, que expressão e as modificações pós-traducionais que permitem a montagem correta e atividade biológica da proteína expressa. Um isolado brasileiro de Dengue virus 1 foi usado para amplificar o gene do envelope ou o gene do envelope fusionado ao gene NS1 por RT-PCR, usando oligonucleotídeos específicos e os fragmentos obtidos foram clonados no vetor de transferência comercial pFastBac1 (Invitrogen). Esse plasmídeo possui regiões sítio-específicas que permitam a transposição do inserto de interesse dentro do genoma de um baculovírus (bacmídeo) propagado em Escherichia coli. O bacmídeo recombinante é usado para a expressão da proteína heteróloga em células de inseto infectadas. Dois vírus recombinantes foram obtidos, vAcDE e vAcDENS1, que foram, então, usados para infectar larvas de Spodoptera frugiperda. Extratos de tecido adiposo de larvas infectadas (96 h.p.i.) foram analisadas por SDS-PAGE e Western- blot, usando um anticorpo contra o vírus do dengue, que detectou um polipeptídeo por volta de 70 kDa em ambos os extratos. Esse polipeptídeo é diferente do tamanho predito da proteína do envelope (~50 kDa) e das proteínas do envelope mais NS1 fusionadas (~90kDa). Entretanto, a análise transcricional confirmou que os genes estavam sendo transcritos em células infectadas. Nós também usamos o virus vAcDENS1 em um ensaio de fusão de membrana e confirmamos a formação de sincício dependente de pH, o que é uma característica da proteína do envelope do vírus do dengue. O gene NS1 foi também clonado em um plasmídeo, sob o comando do promotor hsp70 de Drosophila melanogaster e usado em uma co-transfecção com um plasmídeo contendo um gene de resistência à puromicina, visando a construção de células de inseto estavelmente transformadas. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT

Dengue is the most common mosquito-borne viral disease of humans and its infection may evolve to a potentially lethal disease known as Dengue haemorrhagic fever (DHF). This disease is caused by a positive-sense, single-stranded, enveloped RNA virus that belongs to the genus Flavivirus within Flaviviridae and its genome is organized in a single ORF which encodes three structural proteins (capsid, pre-M, and envelope) and seven non-structural proteins (NS1, NS2a, NS12b, NS3, NS4a, NS4b, NS5). Among the viral proteins, the envelope protein is one of the most antigenic and NS1 play a possible role in complement-mediated cytolysis. Different heterologous expression systems may be used for the expression of viral antigens for vaccine and/or diagnosis development. Among these, the Baculovirus Expression System (BEV) is one of the most popular and efficient system. Baculoviruses have a circular, double stranded DNA genome and infect arthropodes, mainly insects. There are many advantages of using BEV, when compared to other expression systems, such as high expression levels and post-translational modifications that allows the expressed proteins to be correctly folded and biologically active. A Brazilian Dengue 1 isolate was used to amplify the envelope gene alone or envelope plus NS1 gene by RT-PCR using specific oligonucleotides and cloned into the commercial transfer vector pFastBac1 (Invitrogen). This plasmid has site-specific regions which allows transposition of the chosen insert into a baculovirus genome (bacmid) propagated in Escherichia coli. The recombinant bacmid DNA is used to obtain recombinant baculovirus and heterologous protein expression in virus-infected insect cells. Two different recombinant virus were obtained, vAcDE and vAcDENS1, and they were used to infect Spodoptera frugiperda larvae. Fat body extracts of infected larvae (96 h p.i.) were analysed by SDS-PAGE and Western blot using an anti-Dengue antibody which detected a polypeptide around 70 kDa in both extracts. The size of this polypetide is different from the predicted size of the envelope protein (~50 kDa) and the fused envelope and NS1 proteins (~90kDa). However, transcriptional analysis confirmed that the genes were being transcribed in infected cells. We also used the vAcDENS1 virus in a membrane fusion assay and confirmed pH-dependent syncytium formation, which is a characteristic of the dengue virus envelope protein.. The NS1 gene alone was cloned under the control of hsp70 promoter and used to co-transfect insect cells with a plasmid containing the puromycin resistance gene, in order to produce stably transformed insect cells.