Desenvolvimento e mapeamento de marcadores microssatélites e identificação de QTLs ligados à produtividade e à resistência à mancha preta em Arachis spp

Abstract

O amendoim cultivado (Arachis hypogaea) é uma cultura importante, amplamente cultivada nas regiões tropicais e subtropicais do mundo. É bastante susceptível a diversos estresses bióticos e abióticos, para os quais muitas das espécies silvestres são resistentes. Como um primeiro passo visando a introgressão desses genes de resistência no amendoim cultivado, um mapa de ligação foi construído, usando uma população F2, obtida do cruzamento entre duas espécies silvestres diplóides de genoma AA (A. duranensis e A. stenosperma). Esse mapa foi baseado em marcadores microssatélites e marcadores âncoras, ambos codominantes e transferíveis entre espécies aparentadas. Um total de 271 novos marcadores microssatélites foi desenvolvido no presente trabalho, a partir de bibliotecas genômicas enriquecidas para microssatélites, de bibliotecas de etiquetas de seqüências expressas (ESTs ou “expressed sequence tags”) e por mineração (“data mining”) de seqüências disponíveis no GenBank. Para facilitar o desenvolvimento dos marcadores a partir de um grande número de seqüências, foi utilizado um módulo de programas desenvolvido em parceria com a Universidade Católica de Goiás e com a Universidade Católica de Brasília. Esse módulo integra um programa para busca de microssatélites (TROLL), um conjunto de programas para agrupamento e processamento das seqüências (Staden package) e um terceiro programa, para desenho de primers (Primer3). Com isso, o desenvolvimento dos marcadores pôde ser automatizado, tornando o processo bem mais rápido e eficiente. Dos 271 novos marcadores microssatélites, 66 mostraram-se polimórficos para o amendoim cultivado e 62 deles foram utilizados para análise das relações genéticas entre acessos representando as seis variedades botânicas descritas de A. hypogaea. Os resultados obtidos foram consistentes com a classificação taxonômica atual, exceto para as variedades fastigiata/peruviana e fastigiata/aequatoriana, que formaram um grupo separado e distante das outras duas variedades da subespécie fastigiata. Os 271 novos marcadores microssatélites, além de outros 218 publicados ou em publicação para o amendoim foram testados, usando-se os dois progenitores. Desses 489 marcadores microssatélites, 215 (44,0%) mostraram-se polimórficos, sendo 181 codominantes e 34 dominantes (amplificaram alelos nulos em um dos progenitores). Os 99 marcadores microssatélites codominantes que não apresentaram distorções da segregação 1:2:1 esperada (p<0,05), junto aos 40 2 marcadores âncoras não distorcidos (de um total de 72), foram utilizados para o estabelecimento dos grupos de ligação. Em seguida, os marcadores distorcidos e os dominantes foram incluídos no mapa. Usando um LOD escore mínimo de 11, 182 marcadores microssatélites, 66 marcadores âncoras e 12 RGAs foram mapeados em 10 grupos de ligação, como esperado, uma vez que Arachis duranensis e A. stenosperma são espécies diplóides com 2n=20 cromossomos. Um comprimento de mapa total igual a 1645,1 cM foi obtido, com uma distância média de 6,32 cM entre marcadores. Esse mapa foi utilizado para o mapeamento de QTLs que controlam três características de interesse para o melhoramento do amendoim. Dez QTLs que controlam o peso de sementes, oito QTLs que controlam o número de sementes produzidas por planta e dois QTLs para resistência ao fungo causador da mancha preta (Cercosporidium personatum) foram significativamente identificados pelo método de mapeamento por intervalo múltiplo. Esse é o primeiro mapa baseado em marcadores microssatélites desenvolvido para Arachis. Além disso, os primeiros QTLs para componentes da produtividade e para resistência à mancha preta foram mapeados em Arachis spp. Uma vez que a maioria dos marcadores microssatélites utilizados foi desenvolvida a partir de ESTs e de bibliotecas genômicas digeridas com enzimas de restrição sensíveis a metilação, mais da metade dos marcadores mapeados, incluindo os marcadores âncoras, são provavelmente gênicos. Os grupos de ligação identificados nesse trabalho, as ordens dos marcadores obtidas e os QTLs mapeados estão sendo validados em outras populações de mapeamento, visando a construção de um mapa de referência para Arachis e a obtenção de estimativas mais robustas sobre os QTLs identificados, para uso dessas informações nos programas de melhoramento do amendoim. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT

Cultivated peanut (Arachis hypogaea) is an important crop, widely grown in tropical and subtropical regions of the world. It is highly susceptible to several biotic and abiotic stresses to which wild species are resistant. As a first step towards the introgression of these resistance genes into cultivated peanut, a linkage map was constructed, using an F2 population obtained from a cross between two diploid wild species with AA genome (A. duranensis and A. stenosperma). The map was based on microsatellite and anchor markers that are both codominant and transferable among related species. A total of 271 new microsatellite markers were developed in the present study from SSR-enriched genomic libraries, ESTs, and by “data-mining” sequences available in GenBank. To aid the development of microsatellite markers from a great number of sequences, a module, developed in collaboration with the Catholic University of Goiás and the Catholic University of Brasília, was used. This module integrates a program for the detection of microsatellites (TROLL), the Staden Package for the assembly and processing of sequences, and a software for primer design (Primer3). By using this module, the SSR marker development was automated, and the process proved to be fast and efficient. Of the 271 new SSR markers, 66 were polymorphic for cultivated peanut and 62 were used for the genetic relationship analysis of accessions representing the six described botanical varieties of A. hypogaea. Results were consistent with the actual taxonomic classification, except for the fastigiata/peruviana and fastigiata/aequatoriana varieties, which formed a separated group, distant from the other two fastigiata varieties. The 271 new markers plus another 218 published or being published for peanut were screened against both progenitors. A total of 215 (44.0%) were polymorphic, with 181 codominant and 34 dominant markers (amplified null alleles in one of the progenitors). The 99 codominant markers segregating 1:2:1 (p<0.05) plus the 40 non-distorted anchor markers (of a total of 72 markers) were initially used to establish the linkage groups. Distorted and dominant markers were subsequently included in the map. By using a minimum LOD score of 11 and a maximum recombination fraction of 0.35, 182 microsatellite markers, 66 anchor markers and 12 RGAs mapped in 10 linkage groups, as expected, since A. duranensis and A. stenosperma are diploid species with 2n=20 chromosomes. A total map distance of 1645.1 cM was obtained, with an average distance of 6.32 cM between markers. This map was used 4 for the mapping of QTL for three traits of interest for the peanut breeding programs. Ten QTL controlling seed weight, eight QTLs for seed number and two QTLs for resistance against the fungus C. personatum were significantly mapped by using the multiple interval mapping method. This is the first microsatellite-based map published for Arachis. Moreover, the first QTLs for yield components and for resistance to late leafspot were mapped in Arachis spp. Because most markers used were derived from ESTs and genomic libraries made using methylation sensitive restriction enzymes, more than a half of the markers, including the anchor markers, are genic. Linkage group ordering and the mapped QTL are being validated in other mapping populations, with the aim of constructing a transferable reference map for Arachis and to obtain more robust estimates about the mapped QTL for use in the peanut breeding programs.