Estudos de sinalização celular em Hypocrea jecorina (Trichoderma reesei) durante a expressão dos genes de celulase (cbh1 e cbh2) em presença de celulose e soforose e durante o antagonismo contra Pythium ultimum

Abstract

Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) é amplamente utilizado na indústria e seu potencial para o uso na agricultura como agente de controle biológico contra fungos fitopatogênicos começou a ser explorado recentemente. O gene gna3 que codifica para uma proteína G subgrupo III, ativadora de adenilato ciclase de T. reesei, foi clonado para o estudo do seu possível papel no controle da expressão de genes codificadores das celulases (cbh1 e cbh2) por celulose e soforose. Bem como, na produção de enzimas que degradam parede celular (EDPCs), durante o antagonismo contra Phytium ultimum. A linhagem mutante de T. reesei que possui uma cópia modificada de gna3 para expressão de uma versão da proteína GNA3 (gna3QL) que se mantém ativada exibiu elevado conteúdo intracelular de AMPc e uma diminuição na esporulação, mas sem afetar a taxa de crescimento vegetativo no escuro e um aumento de 20% dessa taxa em presença de luz. Consistente com o comportamento da linhagem selvagem, nenhuma transcrição de genes de celulase ocorre na ausência de indutor. Entretanto, o mutante mostra um aumento na transcrição de celulase em presença de celulose, mas somente em presença de luz. O nível de transcrição de celulase no escuro é similar o da linhagem parental TU-6. Por outro lado, quando soforose foi utilizada como indutor, transcritos de cbh1 e cbh2 tiveram nível mais alto de transcrição quando as culturas foram mantidas no escuro do que na presença de luz. A transcrição de gna3 é aumentada em presença de luz. Todavia, genes conhecidamente regulados por luz, blr1, blr2 e env1 são igualmente transcritos no mutante gna3QL como no tipo selvagem. Durante o antagonismo contra P. ultimum, o mutante gna3QL, como a linhagem parental TU-6 inibiram o crescimento de P. ultimum no teste de confronto. O mutante gna3QL cresceu mais rápido do que a linhagem parental TU-6 nos primeiros 3 dias, mas cresceu mais devagar que o T. harzianum (ALL42). A microscopia eletrônica de varredura mostrou que o mutante gna3QL promoveu maiores alterações morfológicas na parede celular de P. ultimum do que a linhagem parental TU-6. O mutante gna3QL apresentou uma melhor performance na produção de EDPCs como endoquitinase (0,36 U. mL-1), N-acetil-?-D-glicosaminidase (NAGase) (2,62 U. mL-1) , ?-1,3-glicanase (5 U. mL-1), lipase (2,94 U. mL-1) e fosfatase ácida (11,81 U. mL-1), após 72 horas de incubação em meio líquido contendo parede celular de P. ultimum como fonte de carbono. Entretanto, a linhagem parental TU-6 apresentou uma maior atividade de celulase (10,3 U. mL-1) do que o mutante gna3QL (6,64 U. mL-1) e nenhuma diferença significativa na atividade de protease entre as duas linhagens foi observada. Os resultados mostram que GNA3 está envolvida na regulação da expressão de genes de celulase (cbh1 e cbh2) por celulose e este processo é dependente de luz. Além disso, a produção de algumas EDPCs durante o micoparasitismo por T. reesei contra P. ultimum pode estar associada com a atividade de GNA3 e/ou com o aumento intracelular dos níveis de AMPc. __________________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) is widely used in industry and its potential for use in agriculture as a biocontrol agent against phytopathogenic fungi has just begun to be explored. The adenylate cyclase activating subgroup III Gproteinencoding gene gna3 of T. reesei was cloned to study its possible role in the control of cellulose and sophorose to cellulase (cbh1 and cbh2) gene expression as well in production of cell wall-degrading enzymes (CWDEs) during antagonism against Pythium ultimum. A mutant strain of T. reesei bearing a modified copy of gna3 for expression of a kept activated version of GNA3 protein (gna3QL) exhibits elevated intracellular cAMP levels and decreased sporulation, but was unaffected in its growth rate in dark and an increase in this rate of about 20% in light. Consistent with the behavior of the wild-type strain, no cellulase transcription occurs in this mutant in the absence of an inducer. However, the mutant shows an increase in cellulase transcription in presence of cellulose, but only in the presence of light. Cellulase transcription level in the dark is similar to the parent strain. On the other hand, when sophorose was used as inducer, transcript levels of cbh1 and cbh2 were higher when cultures were kept in the dark than in presence of light. The transcription of gna3 is increased in the presence of light. Nevertheless the light regulatory genes blr1, blr2 and env1 are transcribed similarly in the gna3QL mutant as in the wild-type. During antagonism against P. ultimum, the mutant gna3QL, like the parental TU-6 strain, inhibited the growth of P. ultimum in dual culture assay. The mutant gna3QL grew faster than the parental TU-6 strain within the first 3 days but grew more slowly than the T. harzianum (ALL42). Scanning electron microscopy showed that the mutant gna3QL promoted more morphological alterations of P. ultimum cell wall after interaction than the parental TU- 6 strain. The mutant gna3QL showed a better performance in production of CWDEs such as endochitinase (0.36 U. mL-1), N-Acetyl- _ -D-glucosaminidase (NAGase) (2.62 U. mL-1), _-1,3-glucanase (5 U. mL-1), lipase (2.94 U. mL-1) and acid phosphatase (11.81 U. mL-1), after 72 hours of incubation in liquid medium containing P. ultimum cell wall as the carbon source. However, the parental TU-6 strain showed higher cellulase activity (10.3 U. mL-1) than the mutant gna3QL (6.64 U. mL-1) and no significant difference was observed in protease activity between the two strains. The results showed that GNA3 is involved in light-regulated cellulase gene expression (cbh1 and cbh2) on cellulose. Furthermore, the production of some CWDEs during mycoparasitism by T. reesei against P. ultimum can be associated with GNA3 activity and/or increase in intracellular cAMP levels.