siRNAs sintéticos direcionados à no sintase neuronal : efeitos sobre a expressão gênica e viabilidade celular do glioma

Abstract

O objetivo do atual estudo foi avaliar os efeitos do small-interfering RNA (siRNA) e28_hnNOS sobre a expressão gênica da enzima NO sintase neuronal (nNOS) e sobre a viabilidade celular de gliomas. O glioma apresenta alta ocorrência entre os tumores cerebrais e tem o pior prognóstico. Entre os vários mediadores da tumorigênese, situa-se o óxido nítrico (NO), formado pelas enzimas NO sintases. A isoforma nNOS é expressa em tumores cerebrais, e está associada ao seu grau de malignidade. No presente estudo foi desenvolvido o siRNA e28_hnNOS para interferência de RNA sobre sequência-alvo do RNAm de nNOS, codificada pelo exon 28. Células de glioma U-251MG, cultivadas em triplicatas, foram transfectadas com este siRNA de 21 nucleotídeos (37,5nM) estruturado em lipossomas catiônicos, para análise nos tempos de 4, 24 e 48 horas pós-transfecção, havendo o controle negativo scramble. O conteúdo de RNAm de nNOS foi quantificado por RT-qPCR e os resultados expressos pelo método de 2-ΔΔCT. O siRNA e28_hnNOS alterou o conteúdo de nNOS, com expressão de 0,61 vezes em relação ao controle negativo scramble no tempo 24hs e, surpreendentemente, aumento de 1,4 vezes no tempo 48hs. O efeito do siRNA e28_hnNOS sobre a viabilidade celular foi determinado pelo ensaio de MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina). Células foram lesadas com neomicina (300 μg/ml) por 24 horas e transfectadas com o siRNA (37,5nM) por 4 horas, havendo grupo controle não lesado. O uso do siRNA e28_hnNOS combinado com a neomicina reduziu a viabilidade celular para 96,36%. Os resultados do presente estudo mostram que a interferência de RNA via siRNAs pode controlar a expressão gênica de nNOS em gliomas e revelam o potencial uso deste método, em associação com a neomicina, para obtenção de efeitos antiproliferativos. _________________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT

The aim of the present study was to test effects of the siRNA e28_hnNOS on neuronal nitric oxide synthase enzyme (nNOS) content and cell viability of glioma cells in culture. Glioma is an aggressive cerebral tumor that holds a very poor prognosis. Nitric oxide synthase enzymes and their respective product - nitric oxide (NO) have a role in cancer development and metastasis. In our study, we tested the siRNA e28_hnNOS, which targets to nNOS mRNA sequence coded by exon 28. For that, glioma cells U-251MG in culture were transfected with e28_hnNOS (37,5 nM) mixed with cationic liposomes. They were tested at the time-points 4, 24, and 48 hours. The negative control was the commercial scramble All-Stars™ (Qiagen™). The nNOS mRNA content was quantified by RT-qPCR and the results were expressed by the method 2-ΔΔCT. The nNOS content was reduced to 0.61 fold to the scramble negative control value at 24 h. Surprisingly, we found a 1.4 fold increase at 48 h post-transfection. The siRNA effects on cell viability were determined by MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina) assay. Cells were previously lesioned with neomycin (300 μg/ml) for 24 h and then treated with e28_hnNOS for 4 hour. Non-lesioned and scrambled control groups were included. The use of siRNA e28_hnNOS in combination with neomycin reduced the cell viability to 96.36%. In conclusion, our results show the ability of siRNAs to change the nNOS mRNA content in glioma cells in culture and reveal the potential use of RNA interference in combination with neomycin for antiproliferative effects.