Anticorpos IgG murinos de diferentes isotipos e região variável idêntica se ligam de forma diferente à cápsula de Cryptococcus neoformans e a receptores Fc-gama

Abstract

É estimado que ocorram 625 mil mortes por ano no mundo por meningite criptococócica, a maioria indivíduos infectados por HIV. Cryptococcusneoformans é o responsável pela maioria dessas mortes. Visto que tratamento da criptococose com antifúngicos convencionais tem se mostrado menos eficaz do que o ideal, anticorpos monoclonais contra a cápsula do fungo foram desenvolvidos nas últimas três décadas com objetivo de criar novas ferramentas terapêuticas. No entanto, ao tratar camundongos com diferentes isotipos de anticorpos, diferentes respostas protetoras foram observadas. Por exemplo, tratamento com anticorpo monoclonal 3E5 IgG1 de camundongos infectados com C. neoformans resultou em aumento da sobrevida, enquanto os animais tratados com anticorpo de região variável idêntica mas com isotipo IgG3 apresentaram resposta agravante de doença. Ensaios de ligação ao antígeno por imunofluorescência mostraram que os padrões de ligação destes dois isotipos de 3E5 à cápsula são diferentes, o que pôs em questão o conceito clássico de que a ligação ao antígeno é exclusivamente determinada pelas porções variáveis do anticorpo. Além destas diferenças de ligação ao antígeno, diversos estudos publicados a partir da década de 1980 sugerem que o isotipoIgG3 interage com um receptor de Fc na superfície de macrófagos que é diferente dos que se ligam aos outros isotipos, o que também poderia explicar diferenças na proteção conferida pelos anticorpos 3E5 de diferentes isotipos de IgG. Tendo em vista a importância terapêutica de se conhecer adequadamente os mecanismos pelos quais um mesmo anticorpo IgG pode ser protetor ou não, dependendo de seu isotipo, este trabalho teve por objetivos produzir novos anticorpos monoclonais recombinantes, avaliar seu padrão de ligação ao antígeno e sua capacidade de mediar fagocitose por receptores de Fc. Dois pares de anticorpos IgG1 e IgG3 foram produzidos por meio de expressão heteróloga em células de mamífero. O primeiro par deriva do anticorpo monoclonal 2H1, anticorpo contra a cápsula de C. neoformans cuja estrutura cristalográfica já foi resolvida. O segundo par deriva do anticorpo 4-4-20, que reconhece o hapteno FITC, e foi gerado a fim de avaliar se a resposta efetora mediada por receptores é exclusiva de anticorpos contra C. neoformans. Os domínios variáveis das cadeias pesada e leve dos anticorpos foram gerados por síntese química e clonadas em vetores para expressão de IgG1 e IgG3 murinos, que foram então transfectados em células CHO e NSO. As condições de transfecção e purificação foram otimizadas e resultaram na produção de lotes dos anticorpos suficientes para testes funcionais. A ligação dos anticorpos a células de C. neoformans foi testada por imunofluorescência indireta e sua capacidade de mediar fagocitose testada com macrófagos J774 e células CHO-K1. Os anticorpos 2H1 apresentaram padrão de fluorescência semelhante aos de 3E5, com padrão de ligação a células de C. neoformans anular para IgG1 e puntiforme para IgG3. Os dois isotipos de anticorpos 2H1 e 4-4-20 foram também funcionais em testes de fagocitose por macrófagos. Os anticorpos de isotipoIgG1 mostraram dependência exclusiva dos receptores Fcγ, enquanto que 2H1-IgG3 foi capaz de mediar fagocitose mesmo com esses receptores bloqueados. Portanto, os anticorpos recombinantes produzidos foram funcionais e permitiram a realização de experimentos importantes, que evidenciaram que a cadeia pesada pode alterar a ligação do anticorpo ao antígeno e comprovaram que o isotipoIgG3 pode mediar fagocitose por meio de um receptor desconhecido.