Produção de holocelulases por Clonostachys byssicola cultivado em casca de soja : purificação parcial e caracterização de uma endoglicanase

Abstract

O fungo filamentoso Clonostachys byssicola foi cultivado por sete dias em meio líquido contendo casca de soja 1 % (m/v) como única fonte de carbono. A capacidade do fungo em secretar enzimas holocelulolíticas foi avaliada, sendo observadas atividades de CMCase, FPase, mananase, pectinase e xilanase no extrato bruto. CMCase (0,904 UI/mL) foi escolhida como principal alvo de investigação. O extrato bruto foi concentrado por ultrafiltração em membrana com retenção de 10 kDa, e CMCase presente no extrato concentrado foi parcialmente purificada utilizando coluna cromatográfica de exclusão molecular (Sephacryl S100) e de troca iônica (Q Sepharose e DEAE Sepharose Fast Flow). CMCase presente no extrato concentrado e frações reunidas oriundas das colunas de troca iônica foram caracterizadas. A enzima semi purificada apresentou maior atividade a 60-70 °C e pH 5,0, sendo termoestável a 40 °C e 50 °C e possui massa molecular de aproximadamente 48 kDa. Compostos fenólicos (vanilina, ácidos tânico, 4-hidroxibenzóico, ferúlico, ρ-coumárico e cinâmico) não tiveram efeito inibitório e de desativação sobre a atividade celulolítica. Os íons Cu2+, Fe2+, Fe3+ e Zn2+ na concentração de 10 mM inibiram atividade de CMCase em até 70 %, 94 %, 100 % e 44 %, respectivamente; o íon Co2+ (10 mM) ativou a atividade enzimática das frações Cel-QFF e Cel-DEAE em 21 % e 25 %, respectivamente. Os valores de kM e Vmáx de CMCase foram 24,93 mg/mL e 2,14 UI/mL (no extrato concentrado); e 15,81 mg/mL e 0,59 UI/mL (na fração Cel-DEAE), respectivamente. Foram realizados ensaios de hidrólise enzimática de avicel, CMC, papel de filtro, manana e xilana e substratos lignocelulósicos (casca de soja e bagaço de cana de açúcar) com enzimas do extrato concentrado e fração Cel-QFF. Os principais produtos de hidrólise enzimática de CMC e papel de filtro foram glicose, celopentaose e celohexaose. A hidrólise enzimática de casca de soja liberou maior quantidade de açúcar que a hidrólise de bagaço de cana de açúcar, sugerindo que as enzimas secretadas durante o crescimento de C. byssicola possuem atividade enzimática mais proeminente sobre o substrato utilizado como fonte de carbono. __________________________________________________________________________________________ ABSTRACT

The filamentous fungus Clonostachys byssicola was cultivated for seven days in liquid medium containing soybean hulls 1 % (w/v) as the sole carbon source. The fungus's ability to secrete holocellulolytic enzymes was evaluated and activities of CMCase, FPase, mannanase, pectinase and xilanase were observed in the crude extract. CMCase (0.904 IU/mL) was chosen as the main target of research. The crude extract was concentrated by ultrafiltration membrane with retention of 10 kDa, and CMCase present in the concentrated fraction was partially purified using molecular exclusion (Sephacryl S100) and ion exchange chromatography columns (Q Sepharose and DEAE Sepharose Fast Flow). CMCase present in the concentrated fraction and pooled fractions from the ion exchange columns were characterized. The semi purified enzyme exhibited higher activity at 60-70 °C and pH 5.0, being thermostable at 40 °C and 50 °C and has a molecular mass of approximately 48 kDa. Phenolic compounds (vanillin, tannic, 4-hydroxybenzoic, ferulic, ρ-coumaric and cinnamic acids) had no inhibitory and deactivation effects on cellulolytic activity. Cu2+, Fe2+, Fe3+ and Zn2+ at a concentration of 10 mM inhibited CMCase activity by 70 %, 94 %, 100 % and 44 %, respectively; Co2+ (10 mM) activated enzyme activity of the Cel-QFF and Cel-DEAE fractions by 21 % and 25 %, respectively. KM and Vmax values of CMCase were found to be 24.93 mg/mL and 2.14 IU/mL (concentrated fraction); and 15.81 mg/mL and 0.59 IU/mL (Cel-DEAE fraction), respectively. Enzymatic hydrolysis of avicel, CMC, filter paper, xylan and mannan and lignocellulosic substrates (soybean hulls and sugar cane bagasse) were performed with enzymes of the concentrated fraction and Cel-QFF fraction. The main enzymatic hydrolysis products of CMC and filter paper were glucose, cellopentaose and cellohexaose. Enzymatic hydrolysis of soybean hulls released higher sugar amount than the hydrolysis of sugarcane bagasse, suggesting that the enzymes secreted during the growth of C. byssicola have more prominent enzyme activity on the substrate used as a carbon source.