Estudo funcional da proteína de movimento (NSm) de distintos Tospovirus

Abstract

Vírus de planta desenvolveram uma classe de proteínas responsáveis por garantir a infecção e disseminação viral. Estudos vêm demonstrando que essa classe de proteínas de movimento (MPs), interage com o plasmodesma (PD), aumentando o seu limite de exclusão (LEP), possibilitando a passagem dos vírus. Várias estratégias são utilizadas para o estudo de movimento viral. Alguns sistemas baseiam-se na utilização de clones infecciosos que possibilitam a inserção de genes heterólogos de MPs. Para o estudo do movimento célula à célula e sistêmico utilizamos o vetor viral Alfalfa mosaic virus (AMV). O sistema consiste na utilização de transgênicos P12 em combinação com transcritos do RNA 3 adaptados para a inserção de genes heterólogos. Com base neste sistema, demonstramos que a proteína de movimento NSm, pode ter relação com a limitação ou amplitude no espectro de infecção viral devido às diferenças significativas observadas no movimento célula à célula e sistêmico de tospovírus que apresentam características moleculares e biológicas distintas (Capítulo II). Concluímos que a movimentação das espécies do gênero tospovírus é dependente da formação de vírions baseado no contexto AMV de infecção e movimentação (Capítulo II). Também concluímos que as MPs de 4 espécies de tospovírus estudadas, são eficientes na formação de túbulos. Em ensaios de truncamento das MPs observamos que para o BeNMV, o extremo C-terminal não é essencial para o movimento, a partir da identificação do limite de aminoácidos que poderiam ser deletados da MP sem inibição do movimento célula à célula. Contrastantemente, as MPs dos vírus CSNV, TCSV e TSWV demonstraram a necessidade da integridade da proteína para garantia do movimento (Capítulo II). Com a utilização das metodologias de “biomolecular fluorescence complementation” (BiFC) e tratamentos químicos com Na2CO3 e Ureia, a partir das MPs, sugerimos que as NSm se associam a membrana de forma periférica. Baseado em predições de hidrofobicidade e orientação topológicas (BiFC topology) sugerimos o modelo de interação da NSm com membrana celular, onde a região central hidrofóbica está mergulhada na periferia das membranas lipídicas e os extremos C e N-terminal livres apontados ao citoplasma (Capítulo III). Finalmente, com a metodologia de BiFC de interação, a partir de ensaios de dímeros, heterodímeros, intra-associação e inter-associação de homólogos e heterólogos de MP e NP (nucleoproteína) observamos que: i) todas NSm e N são eficientes na formação de dímeros ii) as NSm interagem com a sua N cognata e iii) nós observamos interação entre NSm, N e NSm-N entre espécies distintas de tospovírus. Estes resultados podem facilitar uma melhor interpretação das interações de proteína viral com especial ênfase na compreensão das questões de infecção mista. Além do uso de transgênicos na expressão de proteínas heterólogas para geração de resistência, abordagens através do uso de resistência natural também vem sendo exploradas contra espécies do gênero Tospovirus. O presente estudo avaliou o envolvimento de 4 NSm de distintos tospovírus com a resposta de resistência (reação de hipersensibilidade e necrose) mediada pelo gene Sw5-b inserido em plantas de Nicotiana benthamiana. Substituições dos aminoácidos de posição C118Y e T120N da proteína NSm, caracterizados como cruciais para resistência foram realizados. BeNMV, CSNV, TCSV e TSWV NSm wt fusionadas a HA (Hemagglutinin), em processo de agroinfiltração, foram desafiadas contra plantas de N. benthamiana transformadas com gene Sw5-b. Observamos a possível quebra de resistência a partir da NSm do BeNMV, onde não observou-se reação necrótica. Plantas infiltradas com as demais NSm reagiram com resposta necrótica (Capítulo IV). Novo ensaio com vetores contendo as NSm com modificação dos aminoácidos C118 por Y e T120 por N foi desenvolvido. Baseado no resultado do ensaio anterior, as MPs que continham os aminoácidos essenciais para ruptura da resistência, foram modificadas por aminoácidos que não garantem a ruptura e o contrário foi feito para aquelas MPs que não ultrapassaram a resistência. Com base nessa abordagem observamos que CSNV, TCSV e TSWV NSm superaram a resistência sem a formação de necrose foliar, resultado que difere do observado com as mesmas MPs sem mutação, e intrigantemente, a BeNMV NSm aparentemente também superou a resistência sem a formação de lesões locais e necrose foliar após a modificação dos aminoácidos, dado contrastante. No contexto de infecção viral utilizando o sistema AMV, não obtivemos resultados satisfatórios de manutenção ou ruptura da resistência. (Capítulo V). No gênero Tospovirus, pouco se sabe sobre o sítio de replicação ou sobre envolvimento de organelas celulares com o processo de infecção. Existem apenas evidências de expressão isolada das proteínas virais co-localizando com filamentos de Actina e miosina, Membrana, ER e Complexo de Golgi. No presente estudo, com auxílio de metodologia de BiFC, além de ensaio com expressão heteróloga da NSm no contexto de infecção do vírus Potato virus X (PVX), visualizamos a associação da NSm de tospovírus com cloroplatos. Hipotetizamos o possível envolvimento dessa organela com processo de infecção dos tospovírus (Capítulo IV).