Produção e caracterização físico-química e biológica da proteína recombinante fator estimulador de colônias de granulócitos humano (hrg-csf)

Abstract

O Fator Estimulador de Colônias de Granulócitos (G-CSF) é um fator de crescimento hematopoiético cuja função é estimular a proliferação, diferenciação e ativação de células precursoras de neutrófilos da medula óssea. É caracterizado como uma proteína de massa molecular de 18,8 KDa, constituída de 175 resíduos de aminoácidos. A proteína é estabilizada por duas pontes dissulfeto intramoleculares nas posições Cys(36)- Cys(42) e Cys(64)-Cys(74) e apresenta um resíduo de Cisteína (Cys) livre na posição 17. O hrG-CSF (Filgrastima) foi aprovado em 1991 pelo FDA para tratamento de neutropenia induzida por quimioterapia. Atualmente tem sido utilizado para tratamento de neutropenia oriunda de outras doenças como AIDS e Leucemia, com o objetivo de diminuir infecções oportunistas. O primeiro biofármaco recombinante do G-CSF foi produzido em Escherichia coli em 1986 pela empresa AMGEN, e teve sua patente expirada em 2006, tornando-se alvo de produção de biossimilares pelas indústrias farmacêuticas. Visto que o Brasil é um importador deste biofármaco, o que leva a gastos elevados para o Sistema Único de Saúde, o objetivo do trabalho foi desenvolver uma tecnologia de produção, com custos reduzidos, em âmbito nacional. Para tanto, a região codificadora da proteína foi sintetizado utilizando-se códons preferenciais para E. coli e clonado em vetor de expressão pET28a+ por empresa especializada. Foram realizados testes de expressão utilizando-se a cepa BL21(DE3), onde a proteína foi expressa em corpos de inclusão e a melhor condição estabelecida foi utilizando-se o meio LB contendo Canamicina 30 μg.mL-1, a 37 °C com agitação de 200 rpm por 4 horas. Na tentativa de solubilizar os corpos de inclusão e purificar a proteína, alguns protocolos foram testados, e neste trabalho foi desenvolvido um método inovador para lavagem e solubilização com solvente específico. A proteína foi purificada utilizando-se também um processo inovador, em apenas uma etapa. A identidade da proteína foi confirmada por western-blot e espectrometria de massa, e sua atividade foi confirmada por ensaio biológico in vivo, com diferentes concentrações do hrG-CSF purificado utilizado o medicamento comercial como referência. Neste trabalho foi estabelecido um processo simples e de baixo custo para produção e purificação de G-CSF humano recombinante ativo em células de E. coli, de extrema importância para o desenvolvimento da metodologia adequada visando o escalonamento para e produção do biossimilar em escala industrial. ___________________________________________________________________________________________ ABSTRACT

The human recombinant Granulocyte Colony-Stimulating Factor (hrG-CSF) is a hematopoietic growth factor whose function is to stimulate the proliferation, differentiation and activation of neutrophil precursor cells from bone marrow. It is characterized as a 18.8 kDa molecular mass protein composed of 175 amino acid residues. The protein is stabilized by two intramolecular disulfide bonds at Cys (36) - Cys (42) and Cys (64)-Cys (74) positions, with free Cysteine residue (Cys) at position 17. The hrG-CSF (Filgrastim) was approved by the FDA in 1991 for neutropenia treatment induced by chemotherapy. Actually it has been used to treat neutropenia arising from other diseases such as AIDS and leukemia, with the aim of reducing opportunistic infections. The first recombinant G-CSF biopharmaceutical of was produced in Escherichia coli in 1986 by the AMGEN company, which patent was expired in 2006, starting the production of filgrastim biosimilars by pharmaceutical companies. Since Brazil is an importer of biopharmaceuticals, which leads to high spending for the National Health System, the study aimed to develop a production technology with reduced costs, nationally. Therefore, the protein coding region was synthesized using E. coli preferential codons and cloned into the expression vector pET28a by a specialized company. Expression tests were performed using BL21 (DE3) strain. The protein was produced as inclusion bodies. The best expression condition was established using LB medium containing 30 μg.mL-1 of Kanamycin at 37 °C, 200 rpm for 4 hours. Aiming to solubilize the inclusion bodies and purifying the protein, some protocols were tested, and a novel method for washing and solubilization of includion bodies with specific solvent was developed. The protein was purified also with an innovative process, on just one step. The protein identity was confirmed by Western blot and mass spectrometry, and its activity was confirmed by in vivo bioassay with different concentrations of purified recombinant HRG-CSF using commercial drug as reference. In this study, we established a simple and low cost process for production and purification of recombinant active G-CSF in E. coli cells, extremely important for the development of an appropriate methodology for production on industrial scale biosimilar drug.