Utilização da 4-aminopiridina e de toxinas de aracnídeos na investigação da participação de canais para o íon potássio nos processos de aprendizagem e memória

Abstract

Os canais para K+ são agrupados em quatro famílias sendo uma delas a de canais voltagem-dependentes (Kv). Os canais Kv estão presentes na formação hipocampal, estrutura chave na consolidação da memória declarativa e espacial. Apesar de trabalhos mostrem a participação de canais para K+ nos processos de aprendizagem e memória, não está claro qual o papel dos canais Kv. Em função de evidências da literatura, acreditamos que canais Kv subtipo 1.1 (Kv1.1) contribuem positivamente para a formação de memória espacial enquanto os Kv subtipo 2.1 (Kv2.1) têm efeito oposto no mesmo fenômeno. O objetivo deste trabalho é testar essa hipótese. Para ratificar a influência dos canais Kv na memória espacial, além de padronizar testes comportamentais e eletrofisiológicos relacionados a processos da memória, foi utilizada a 4-aminopiridina (4-AP), um bloqueador seletivo para canais Kv, e a escopolamina, um antagonista de receptor muscarínico com comprovado efeito amnésico. Também foram selecionadas duas toxinas para os testes: HgeTx1 e ScTx1. A HgeTx1 é um peptídeo do escorpião Hadrurus gertschi e um bloqueador de canais Kv1.1. A ScTx1 é um peptídeo da aranha Stromatopelma calceata e um bloqueador de canais Kv2.1. Enquanto a ScTx1 foi adquirida comercialmente, a HgeTx1 foi obtida a partir da peçonha de escorpiões por meio de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC, sigla em inglês) e caracterizada quimicamente por meio de espectrometria de massa do tipo MALDI-TOF. A administração das substâncias foi intrahipocampal bilateral na região de CA1 (i.h.) ou intraperitoneal (i.p.). Ratos Wistar machos sob o efeito de diferentes substâncias supracitadas (exceto as toxinas) foram submetidos a três testes comportamentais de aprendizagem e memória espacial: o campo aberto (CA), o labirinto radial de oito braços (LR) e o labirinto aquático de Morris (LAM). Todas as substâncias (incluindo as toxinas) também foram utilizadas em preparações de fatias da formação hipocampal de cérebros (slice) de ratos para verificar seus efeitos sobre a indução de long-term potentiation (LTP) nas sinapses Schaefer-CA1, um dos possíveis mecanismos celulares/moleculares da memória. Os testes comportamentais confirmaram o envolvimento dos canais Kv na memória dependente da formação hipocampal. Os testes no CA mostraram que a escopolamina i.p. (n = 5) provocou prejuízo da habituação espacial, efeito revertido parcialmente pela 4-AP i.h. (n = 5). Nos testes no LR, o bloqueio dos canais Kv pela 4-AP i.h. (n = 6) facilitou tanto a memória operacional quanto a memória de referência, enquanto o desempenho dos animais foi prejudicado pela escopolamina i.p. (n = 6). Os testes com o LAM mostraram resultados semelhantes, pois a 4-AP i.h. melhorou o desempenho dos ratos. Os testes eletrofisiológicos in vitro complementaram os comportamentais. A escopolamina inibiu a indução de LTP (n = 6), enquanto a 4-AP o intensificou (n = 6), achados que reforçam os do CA e LR. Foi também interessante observar que a 4-AP reverteu o efeito supressor da escopolamina (n = 6), resultado semelhante ao obtido no CA. Por fim, a HgeTx1 diminuiu a magnitude do LTP (n = 6) e a ScTx1 o aumentou (n = 6), satisfazendo predições deste trabalho. Os resultados obtidos até o momento não só fortalecem a importância dos canais Kv na aprendizagem e memória espacial, mas também corroboram nossa hipótese sugerindo que os canais Kv1.1 e Kv2.1 possuem efeitos distintos e complementares na formação da memória. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT

K+ channels are the most diverse among ion channels. They are grouped into four families, one of which is the voltage-dependent (Kv) channels. These are widely distributed in the mammalian brain, especially in the hippocampus, a key structure in the consolidation of declarative and spatial memories. Although studies show the involvement of K+ channels in learning and memory, the role of Kv channels in these processes still unclear. Based on previous studies, we believe that Kv subtype 1 (Kv1) channels contribute positively to the spatial memory formation, while Kv subtype 2 (Kv2) have the opposite effect on the same phenomenon. The aim of this work was to test this hypothesis. We used 4-aminopyridine (4-AP), a selective blocker for Kv channels, and scopolamine, a muscarinic receptor antagonist with proved amnesic effect to confirm the influence of Kv channels on spatial memory. Additionally, the same drugs were used to standardizing behavioral and electrophysiological tests related to memory processes. Two toxins were selected for the tests: HgeTx1 and ScTx1. The former is a peptide from the Hadrurus gertschi scorpion, being a Kv1.1 channel blocker. ScTx1 is a peptide from the Stromatopelma calceata spider, being a Kv2.1 channel blocker. While ScTx1 was commercially obtained, HgeTx1 was obtained directly from the scorpion venom by high performance liquid chromatography (HPLC) and chemically characterized by means of MALD-TOF mass spectrometry. Compounds were administered bilateral into CA1 region of the hippocampus (i.h.) or intraperitoneally (i.p.). Male Wistar rats, under the effect of the different substances mentioned above (except toxins), were submitted to three behavioral spatial learning and memory tests: the open field (OF), the eight-arm radial maze (RM) and the Morris water maze (WM). All substances (including toxins) were also used in hippocampal slices of the rat brain to test their effects on the induction of long-term potentiation (LTP) on CA1 pyramidal neurons, a cell/molecular memory model. The behavioral tests confirmed the involvement of Kv channels in hippocampal-dependent memory formation. The OF tests showed that i.p. scopolamine (n = 5) induced a defict in spatial habituation. This effect was partially reversed by i.h. 4 -AP (n = 5). In RM tests, Kv channel blockade by i.h. 4 –AP (n = 6) facilitated working and reference memory, whereas the animal´s performance was impaired by i.p. scopolamine (n = 6). The WM tests showed similar results, since 4-AP improved the rat performance. In vitro electrophysiological tests complemented the behavioral. Scopolamine inhibited LTP induction (n = 6), while 4-AP potentiated it (n = 6), results consistent with the results of from the OF and RM. Interestingly, 4-AP reversed the suppressive effect of scopolamine on LTP (n = 6), similar to the result seen in the OF. Finally, Hgetx1 decreased LTP magnitude (n = 6) and ScTx1 increased it (n = 6), confirming the predictions of the present work. Thus, our results underscore the importance of Kv channels on spatial learning and memory and corroborate our hypothesis that Kv1 and Kv2 channels have distinct and complementary effects on memory.