Análise proteômica e transcriptômica comparativa de E. coli resistente e susceptível ao peptídeo antimicrobiano magainina I

Abstract

As Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde (IRaS) e o aparecimento de cepas multirresistentes representam um grave problema de saúde pública, sendo notória a necessidade de melhor compreender os mecanismos de resistência bacteriana e assim, elaborar antibióticos mais eficazes. Portanto, o objetivo deste trabalho consistiu em identificar, através de técnicas proteômicas e transcriptômicas, genes e proteínas diferencialmente expressos em linhagens de E. coli ATCC 8739 resistentes à magainina I. Para isso foi realizada a caracterização bioquímica através de microdiluição, VITEK®, MicroScan® e MALDI-TOF MS. Em seguida, foram analisadas a transcrição gênica e a expressão protéica por RNA-seq, nanoUPLC-MSE e 2-DE, respectivamente. Os resultados demonstram que as linhagens resistentes podem ser discriminadas por análises no MALDI-TOF MS e que a resistência à magainina I parece ser bastante específica. Utilizando técnicas proteômicas, foram identificadas 10 proteínas superexpressas dentre as quais, as porinas OmpW, OmpF, OmpC e OmpC fragmento 1b e as proteínas OppA, ZraP e MalM, que participam do transporte pela membrana e transdução de sinal. Por outro lado as proteínas GlpB, GlpA, GdpD, que participam do metabolismo de fosfolipídeos, e o regulador transcricional kdgR, DPS, DnaK, relacionado ao processamento de informação genética, estavam subexpressas. Observou-se também 60 proteínas exclusivas na linhagem resistente, que participam principalmente do metabolismo e processamento de informação genética e ambiental. A fim de aumentar a amplitude da análise, técnicas transcriptômicas também foram aplicadas ao mesmo modelo de estudo observando-se 80 genes com expressões diferenciais, principalmente correlacionados com o metabolismo. Dentre esses, a linhagem resistente versus susceptível com magainina I apresentou 5 genes diferenciais, estando 3 deles superexpressos (pspA, secM, xdhB) e 2 subexpressos (cdp, hldD). Os resultados sugerem que a bactéria foi capaz de desenvolver mecanismos de adaptação em resposta à presença de magainina, provavelmente regulando uma complexa rede de múltiplos genes. ______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Healthcare Associated Infections (HAIs) and emergence of multidrug-resistant bacteria represent a serious public heath problem, requesting a better understanding of bacterial resistance’s mechanisms in order to develop more effective antibiotics. Therefore, work aims to identify, through proteomics and transcripomics tools, genes and proteins differentially expressed in E. coli ATCC 8739 magainin I resistant strains. Biochemical characterization was performed by broth microdilution, VITEK, MicroScan and MALDI – TOF MS. Then, gene and proteins expression were analyzed by RNA –seq, nanoUPLC – MS and 2-DE. Results demonstrated that the resistant strains could be discriminated by MALDI- TOF MS analysis and resistance to magainin I seems to be quite specific. By using proteomic tools, ten proteins were upregulated, such OmpW, OmpF, OmpC e OmpC 1b fragment and fifteen proteins, sush GlpB, GlpA, GdpD, transcriptional factor regulator kdgR, DPS and DnaK, were downregulated in resistant strains. The upregulated proteins have been associated to membrance transport and sinal transduction and dowregulated proteins seem to participate in phospholipid metabolism and genetic information processing. It were also observed the presence of 60 unique proteins in the resistant strains that participate in bacterial metabolism, genetic and environmental information processing. In order to increase the knowledge of bacterial resistance, transcriptomic analysis was realized by using the same magainin I-resistant E. coli model being 80 genes identified, with differential expression in resistant strain being mainly related to metabolism. Among these, the comparison between resistant versus susceptible group cultured with magainin I showed five differential expressed genes, being three of them overexpressed (pspA, secM, xdhB) and the others subexpressed (cdp, hldD.) These data suggest that the bacterium was able to develop a adaptation mechanism in response to magainin, probably regulating a complex net formed by multiple genes.