Avaliação de compostos isolados da espécie do Cerrado Clusia pernambucensis G. Mariz em Leishmania (Leishmania) amazonensis

Abstract

A leishmaniose tegumentar, causada por protozoários do gênero Leishmania, é uma doença endêmica que provoca lesões destrutivas e persistentes na pele e mucosas. Os medicamentos disponíveis apresentam toxicidade considerável e observa-se o crescente aparecimento de resistência medicamentosa, o que demonstra a necessidade da busca por compostos mais específicos para tratar esse agravo. A investigação do potencial de substâncias naturais se mostra uma abordagem eficiente, inclusive como parâmetro para a obtenção de compostos semi-sintéticos e sintéticos. Neste estudo, foi testada a atividade leishmanicida in vitro dos extratos das espécies do bioma Cerrado Austroplenckia populnea (Reissek) Lundell (Celastraceae); Clusia pernambucensis G. Mariz (Clusiaceae) e Maprounea guianensis Aubl. (Euphorbiaceae) entre 100 e 1,56 g/mL em formas promastigotas de Leishmania (Leishmania) amazonensis. O extrato acetato de etila da casca do caule de Clusia pernambucensis apresentou atividade com CI50 = 65,0 µg/mL, e a menor citotoxicidade observada em fibroblastos da linhagem celular NIH-3T3, com CC50 = 100,5 µg/mL, sendo selecionado para os estudos químicos. O fracionamento desse extrato por cromatografia em coluna e CLAE permitiu o isolamento de sete substâncias, identificadas por espectroscopia de infravermelho, ressonância magnética nuclear 1H e 13C e espectrometria de massas de alta resolução. Foi isolada e caracterizada uma xantona ainda não relatada na literatura, 6,9-dihidróxi-3,3-dimetil-5-(3-metilbut-2-enil)pirano[2,3-c]xanten-7(3H), denominada pelo nosso grupo de clusiaxantona (CP1). Esse composto apresentou CI50 = 25,3 µg/mL em formas amastigotas de L. (L.) amazonensis no interior de macrófagos peritoneais coletados de camundongos Balb/C, enquanto seu derivado semi-sintético metil éter (1a) obteve CI50 = 22,5 µg/mL. Quatro tocotrienóis ainda não descritos nessa espécie também foram isolados e identificados: ácido Z-?-tocotrienolóico (CP2), ?- tocotrienol (CP3), ?-tocotrienol-metil-éster (CP4), e álcool ?-tocotrienólico (CP5). Os compostos CP3 e CP4 foram isolados pela primeira vez de fonte natural. Em relação a atividade em macrófagos murinos infectados com L. (L.) amazonensis, o ácido Z-?-tocotrienolóico (CP2) mostrou CI50 = 77,3 µg/mL, enquanto que o seu derivado metilado (2a) e os compostos CP3, CP4 e CP5 não apresentaram ação leishmanicida. O ácido betulínico (CP6) e o ?-sitosterol (CP7) também foram isolados. A citoxicidade em macrófagos murinos mostrou CC50 = 17,22 µg/mL para a clusiaxantona (CP1), 32,56 µg/mL para o derivado 1a e 78,04 µg/mL para o ?-tocotrienol-metil-éster (CP4). Outros derivados serão propostos para diminuir a citoxicidade e aumentar a atividade leishmanicida. Os compostos isolados e já caracterizados servirão como base para avançar na busca por candidatos a compostos líderes. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT

Cutaneous leishmaniasis, caused by protozoa of the genus Leishmania, is na endemic disease that causes detructive and persistente lesions in skin and musoux. The available drugs presente significant toxicity and the increasing drug resistance is observed, which demonstrates the need to search for more specific compunds to treat this disease. The investigation of the potential of natural substances shows itself na eficiente approach, including as a parameter jfor obtaining semi-synthetic and synthetic compounds. In this study, we tested the in vitro leishmanicidal activity of extracts from species of the Cerrado biome Austropenckia populnea (Reissek) Lundell (Celastraceae); Clusia Pernambucensis G. Mariz (Clusiaceae) and Maprounea guianensis Aubl. (Euphorbikaceae) between 100 and 1.56 µg /mL in promastigotes of Leishmania (Leishmania) amazonenses. The ethyl acetate extract of the stem bark of Clusia pernambucensis, showed leishmanicidal activity with IC 50=65.0 µg /mL, and the lowest cytotoxicity observed in NIH-3T3 cell line fibrobasts with CC50=100.5 µg /mL, being selected for chemical studies. Fractionation of this extract by column chromatography and HPCL allowed the isolation of seven substances, identified with infrared spectroscopy, nuclear magnetic resonance 1H and 13C NMR and high-resolution mass spectrometry. It was isolated and characterized one xanthone not yet reported in the literature, 6,9-dihydroxy-3, 3-dimethyl-5-(3-methylbut-2enyl) pyrano[2,3-c]xanthen-7(3H), named clusiaxanthone (CP1) by our group. This compound showed IC50=25.3 µg /mL in amastigotes of L. (L.) amazonenses within peritoneal macrophages harvested from Balb/C mice, while its methyl ether semi-synthetic derivativa (1a) obteined IC50=22.5 µg /mL. Four tocotrienoloic not yet described in this specie were also isolated and identified: Z-?-tocotrienoloic acid (CP2), ?-tocotrienol (CP3), ?-tocotrienol-methyl-ester (CP4), and alcohol-? Tocotrienolic (CP5). The compound CP3 and CP4 were furst usikated from a natural source. Regarding the activity in murine macrophages infected with L. (l) amazonenses, the Z-?-tocotrienoloic acid (CP2) showed IC50=77.3 0 µg =/mL, whereas its semi-synthetic methylated derivative 2a and the compound CP3, CP4 and CP5 did not show anti-leishmanial activity. Betulinic acid (CP6) and β-sitosterol (CP7) were also isolated. The cytotoxicity in murine macrophages showed CC50=17.22 ug/mL for clusiaxanthone (CP1), 32.56 µg /mL for the derivative 1a and 78.04 µg /mL for the ?-tocotrienol-methyl ester (CP4). Other derivatives will be proposed to decrease cytotoxicity and increase the leishmanicidal activity. The compounds isolated and already characterized will serve as the basis for progress in the search for candidate lead compounds.