Produção, purificação e caracterização espectrométrica da micotoxina citreoviridina produzida pelo Penicillium citreonigrum em meio de cultura YES (Yeast Extract Sucrose)

Abstract

Micotoxinas são metabolitos secundários produzidos por fungos, podendo contaminar os alimentos no campo ou durante o armazenamento. A citreoviridina, micotoxina produzida principalmente por Penicillium citreonigrum, foi isolada pela primeira vez em 1947 no Japão durante investigações da doença do “arroz amarelo”, que causava beribéri cardíaco agudo. Em maio de 2006, surtos de beribéri foram notificados no Maranhão e amostras de arroz coletadas na região apresentaram P. citreonigrum e citreoviridina. O principal objetivo deste trabalho foi estabelecer um protocolo para produção e purificação de citreoviridina com o intuito de obter material suficiente com alta pureza para conduzir estudos toxicológicos para auxiliar na elucidação do evento do Maranhão. Citreoviridina foi produzida pelo P. citreonigrum cultivado em 48 frascos de 500 mL de meio líquido YES durante 8 dias a 25ºC e extraída com clorofórmio. A concentração de citreoviridina foi determinada por HPLC/PDA contra um padrão comercial. A toxina foi purificada por HPLC semi-preparativa, e caracterizada por UV/VIS, FT-IR, 1H e 13C RMN, LC-MS/MS e LC-MSD TOF. Em média, 29,7 e 85,7 mg foram extraídas do líquido e micélio do meio de cultura YES, respectivamente, totalizando 5,54 g de citreoviridina em 15,3 g de extrato bruto. Aproximadamente 12 g desse extrato foram purificados, obtendo 3,25 g de citreoviridina purificada (27,1% de rendimento). As análises espectrométricas confirmaram a identidade da toxina purificada e as análises cromatográficas e gravimétrica confirmaram sua pureza (100%). _________________________________________________________________________ ABSTRACT

Mycotoxins are secondary metabolites produced by fungi, which may develop in agricultural commodities in the field and/or during transport and storage. Citreoviridin, a mycotoxin produced mainly by Penicillium citreonigrum, was first isolated in 1947 in Japan during the investigation of the “yellow rice” disease, which caused acute cardiac beriberi. In May 2006, an outbreak of beriberi was reported in the State of Maranhão, Brazil, and rice samples collected in the region, was shown to be positive for P. citreonigrum and citreoviridin. The main objective of this work was to establish a protocol for the production and purification of citreoviridin in order to yield enough high purity material to conduct toxicological studies that would help to elucidate the events that occurred in Maranhão. Citreoviridin was produced by P. citreonigrum in 48 flasks of 500 mL YES liquid culture medium for 8 days at 25ºC. The toxin was extracted with chloroform, purified by semi-preparative HPLC from the liquid medium and the mycelium of 48 culture flasks, and fully characterized by UV/VIS, FT-IR, 1H and 13C NMR, LC-MS/MS and LC-MSD TOF. Citreoviridin concentration was determined by HPLC/PDA against a commercial standard. In average, 29.7 and 85.7 mg of citreoviridin were recovered from the liquid medium and mycelium, respectively, yielding a total of 5.5 g citreoviridin from 15.3 g of crude extract. About 12 g of this extract was purified yielding 3.25 g of purified citreoviridin (27.1% yield), which identity was confirmed by the spectrometric analyses. Chromatographic and gravimetric analysis showed that the purified citreoviridin was 100% pure.