Expressão de Fabs específicos para peçonha de Bothrops atrox em Pichia pastoris

Abstract

Os acidentes ofídicos, causados principalmente por serpentes do gênero Bothrops, são uma importante questão de saúde pública no Brasil. O tratamento de suas vítimas é baseado na administração do soro antiofídico produzido a partir do plasma de cavalos imunizados com peçonha. Por ser composto por anticorpos e outras moléculas, todas de origem equina, a utilização do soro pode gerar diversas respostas imunes adversas contra seus componentes, já que são heterólogos ao paciente. Com o objetivo de desenvolver novos anticorpos humanos para uso clínico, foram isolados Fabs específicos para peçonha de Bothrops atrox a partir de uma biblioteca combinatorial de Fabs humanos apresentada na superfície de fagos. Um deles, Fab D12, foi selecionado para expressão. Como sistema de expressão heteróloga do Fab em questão foi utilizada a levedura metilotrófica Pichia pastoris e o gene heterólogo foi posto sob controle do promotor AOX1, que é fortemente ativado na presença de metanol como única fonte de carbono. O melhor nível de produção em frasco, aproximadamente 30 mg/L, foi alcançado fazendo-se o acúmulo de biomassa durante 24 horas a 30 °C em meio contendo glicerol como fonte de carbono e a etapa de indução da síntese do Fab a 20 °C durante 48 horas, com alimentação de metanol a cada 12 horas. A purificação da proteína de interesse foi realizada por cromatografia de afinidade com íons Ni2+ já que ela carrega em sua porção carboxi-terminal uma cauda de histidina que tem afinidade por esses íons. Por meio de teste de ligação direta à peçonha verificou-se que o Fab D12 puro é capaz de reconhecer o extrato bruto da peçonha. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Snake bites, mainly caused by Bothrops snakes, are an important public health issue in Brazil. The treatment of victims is based on the administration of antiophidic serum which is produced from plasma of horses immunized with venom. As it is composed of antibodies and other molecules, all of equine origin, the serum can cause adverse immune responses against various components as they are heterologous to the patient. Aiming the development of new human antibodies for clinical use, it was isolated Fabs specific for the venom of Bothrops atrox from a combinatorial library of human Fabs displayed on the surface of phage. One of them, Fab D12, was chosen for expression. As system for heterologous expression of the Fab in question was used the methylotrophic yeast Pichia pastoris and the heterologous gene was put under the control of AOX1 promoter, which is strongly activated in the presence of methanol as sole carbon source. The higher level of production in flask, approximately 30 mg/L, was achieved by performing the growth of biomass for 24 hours at 30 ° C in media containing glycerol as sole carbon source and induction of the synthesis of Fab at 20 ° C for 48 hours, with methanol feed at each 12 hours. The purification of the protein of interest was performed by affinity chromatography with Ni2+ ions as it carries on its carboxy-terminus a histidine tail which has affinity for these ions. Through direct binding assay was confirmed that pure Fab D12 is capable of recognizing the crude extract of B. atrox venom.