Análise da expressão gênica da proteína homóloga à Scc1/Rad21 do complexo Coesina em Trypanosoma cruzi

Abstract

O complexo Coesina tem a função essencial de assegurar a correta segregação das cromátides irmãs após replicação do DNA. A Coesina atua tanto na mitose como na meiose e é mais bem descrita em leveduras e mamíferos. O complexo se forma pela interação das subunidades proteicas conhecidas como SMC (proteínas de manutenção estrutural dos cromossomos), SMC1 e SMC3, e duas proteínas SCC (proteínas de coesão das cromátides irmãs), a SCC1 (também conhecida como Mcd1 ou Rad21) e SCC3 (SA1 e SA2 em células de mamíferos). Existem poucos estudos sobre a Coesina e sua função em tripanossomatídeos, sendo que foi verificada a presença dos genes para todas as subunidades da Coesina em Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei e a Leishmania major. Em trabalhos recentes do nosso grupo, foi observado que a subunidade SCC1 do complexo Coesina em T. cruzi está presente nas formas amastigotas com localização nuclear, em menor quantidade em epimastigotas distribuída por toda a célula e ausente em tripomastigotas. Desse modo, essa diferença da presença da proteína TcSCC1 nas diferentes formas do parasita nos levou a estudar nesse trabalho a expressão gênica dessa proteína de T. cruzi e sua regulação. Inicialmente, foi realizada uma quantificação relativa do mRNA da proteína SCC1 nas diferentes formas do T. cruzi por RT-PCR em tempo real. As formas amastigotas e tripomastigotas apresentaram uma quantidade relativa semelhante entre si e equivalente à metade da quantidade das formas epimastigotas, o que diverge do observado para a presença da proteína. Assim, é possível que haja um mecanismo regulatório provavelmente pós-transcricional, já que é descrito que esse tipo de regulação é peça chave na modulação da expressão gênica em T. cruzi. Nos experimentos onde foi inibido a transcrição e a transcrição juntamente com a tradução nas formas epimastigotas e amastigotas, observamos uma estabilidade do mRNA da TcSCC1 mais longa em amastigotas e pouco afetada com a inibição da tradução. Essa observação pode explicar a causa da maior abundância da proteína nas formas amastigotas. Embora em epimastigotas o mRNA também seja relativamente estável, a quantidade relativa decresce mais acentuadamente, sugerindo uma meia vida mais curta em epimastigotas. É provável que a regulação pós-transcricional desse mRNA possa estar modulando a expressão do gene TcSCC1 entre as formas do T. cruzi e essa não é dependente da tradução. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT

The cohesin complex has the essential function of ensuring the correct segregation of sister chromatids after DNA replication. The cohesin acts both in mitosis as in meiosis and is best described in yeast and mammals. The complex is formed by the interaction of protein subunits known as SMC (structural maintenance of chromosomes), SMC1 and SMC3, and two proteins SCC (cohesion of sister chromatids), the SCC1 (also known as Mcd1 or Rad21) and SCC3 (SA1 and SA2 in mammalian cells). There are few studies of the cohesin and its function in trypanosomatids, and it was detected the presence of genes for all subunits of cohesin in Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei and Leishmania major. In recent work from our group, we observed that the SCC1 subunit of cohesin complex in T. cruzi amastigotes is present with nuclear localization, in epimastigotes with a lesser amount distributed throughout the cell and absent in trypomastigotes. Thus, this difference of the presence of TcSCC1 protein in the different forms of the parasite led us to study in this work the gene expression of this T. cruzi protein and its regulation. Initially, we performed a relative quantification of TcSCC1 mRNA in the different forms of T. cruzi by real time RT-PCR. The amastigotes and trypomastigotes forms presented a relative similar amount among themselves and as equivalent to half the amount of the epimastigote forms, which differs of that observed for presence of the protein. Thus, there may be a possible post-transcriptional regulatory mechanism, since it is reported that this type of regulation is a key part in the modulation of T. cruzi gene expression. In experiments where transcription was inhibited and transcription along with translation in epimastigotes and amastigotes, we observed longer stability of TcSCC1 mRNA in amastigotes and is not affected by the inhibition of the translation. This observation may explain why the protein is more abundant in amastigotes. Although in epimastigotes the mRNA is also relatively stable, the relative amount decreases more markedly, suggesting shorter half life in epimastigotes. It is likely that post-transcriptional regulation of this mRNA may be modulating the TcSCC1gene expression between the forms of T. cruzi and that is not dependent on translation.