Construção da biblioteca de cDNA da glândula de peçonha do escorpião Opisthacanthus cayaporum e clonagem de genes que codificam para componentes da peçonha

Abstract

A peçonha de escorpiões é uma complexa mistura de peptídeos que modulam canais iônicos, antimicrobianos, potencializadores de bradicinina, hemolíticos, e com outras atividades biológicas, sendo importante alvo de estudos para o desenvolvimento de novos fármacos. Os estudos de caracterização proteômica, principalmente com escorpiões da família Buthidae, têm descrito várias toxinas, contudo há pouco conhecimento sobre os processos celulares da glândula de peçonha. A metodologia de busca por ESTs tem sido utilizada em vários trabalhos porque é um método rápido e confiável para a detecção dos genes expressos na glândula, que sintetizam produtos conhecidos ou não. O presente trabalho é o primeiro estudo de caracterização dos transcritos da glândula de peçonha do escorpião brasileiro Opisthacanthus cayaporum (Ischnuridae), por meio da construção de uma biblioteca de cDNA. Foram analisadas 130 ESTs, resultando em 67 seqüências de nucleotídeos distintas com alta qualidade, sendo formadas por em média 535 pares de bases (variando entre 139 e 902 nucleotídeos). Das 130 ESTs, 30% são prováveis toxinas de O. cayaporum, (7 contigs e 8 singletos), 36% correspondem a proteínas relacionadas a diferentes processos celulares (16 singletos e 4 contigs), 17% são seqüências que não foi possível atribuir função, pois apresentaram expectância >10-5, 15% seqüências que não foi encontrada identidade com peptídeos depositados no GenBank e 6% correspondem a seqüências caracterizadas de genomas. Foram descritas 15 seqüências distintas com identidade a toxinas, sendo 9 semelhantes à toxinas bloqueadoras de canais para potássio, 4 toxinas sem pontes dissulfeto e com atividade antimicrobiana e 2 seqüências com identidade a fosfolipases. As seqüências de aminoácidos obtidas a partir da caracterização da biblioteca de cDNA, neste trabalha, apresentaram distribuição de massas moleculares semelhante àquelas descrita pela análise proteômica de O. cayaporum. A seqüência nomeada Cayaporina (NDBP 3.7), de massa teórica calculada de 4675 Da, foi purificada da peçonha bruta e teve sua seqüência de aminoácidos obtida por seqüenciamento de novo e por degradação de Edman. Esse peptídeo possui atividade antimicrobiana contra Escherichia coli, em concentração de 28µM e também inibiu o crescimento em 56% de Staphylococcus aureus, não tendo atividade hemolítica em hemácias humanas. Este trabalho demonstrou a riqueza e diversidade de componentes da peçonha dessa espécie, e foi caracterizado o primeiro peptídeo antimicrobiano não hemolítico isolado da peçonha de O. cayaporum. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT

Scorpions venom are a complex mixture of peptides that modulate ion channels, antimicrobials, bradykinin-potentiating, hemolytic, and other biological activities, and they are a potential source of pharmacological agents and physiological tools. The proteomics characterization, specially with the family Buthidae, have described several toxins, but there is little knowledge about the cellular processes of the gland. The ESTs approach has been used in several works because it is a rapid and reliable method for gene discovery, which synthesize products known or not. This work is the first study to characterize the transcripts of the venom gland of the scorpion Brazilian Opisthacanthus cayaporum (Ischnuridae), by constructing the library of cDNA. We analyzed 130 ESTs, resulting in 67 unique sequences with high quality and is formed by an average of 535 bp (ranging between 139 and 902bp). Of the 130 ESTs, 30% are toxins-like sequences (7 contigs and 8 singlets), 36% are sequences involved in gene and protein expression (16 singlets and 4contigs), 17% are sequences that was not possible to assign function and that may be new toxins have not described, 15% sequences that was not found identity with peptides deposited in GenBank and 6% are characterized by sequences of genomes. Fifiteen unique sequences had identity with the toxins, nine similar to potassium-channel-specific toxin, four NDBPs with antimicrobial activity and two sequences with identity will fosfolipases. Data obtained by the library of cDNA were linked with the molecular masses of O. cayaporum proteomics characterization, and observed that there is similarity in the distribution of molecular masses. The sequence named Cayaporina, theoretical mass calculated is 4675 Da, was purified from crude venom and had its sequence of amino acids obtained by de novo sequencing and Edman degradation. This peptide has antimicrobial activity againt Escherichia coli, a concentration of 28 μM also inhibited the growth in 56% of Staphylococcus aureus, not having hemolytic activity in human erythrocyte. This study demonstrated the richness and diversity of components of the O. cayaporum venom, and was characterised the first antimicrobial peptide not hemolytic isolated from the O. cayaporum venom, appointed Cayaporina (systematic name: NDBP 3.7).