Minimização da agregação proteica de fragmentos de anticorpos de cadeia única (scFv) com aplicação em terapias de células CAR-T

Abstract

O mieloma múltiplo (MM) é um tipo de câncer hematológico caracterizado pela proliferação anormal de células plasmáticas, que apresentam superexpressão do antígeno de maturação de células B (BCMA). Apesar dos avanços nos tratamentos, o MM ainda é considerado incurável. A imunoterapia com células T geneticamente modificadas para expressar receptores quiméricos de antígeno (CAR-T) representa uma importante mudança de paradigma contra neoplasias hematológicas, incluindo MM. No entanto, a exaustão celular das células CAR-T, mesmo na ausência do alvo, é um fator limitante da eficácia desta abordagem. Um dos fatores que contribui para a exaustão das células CAR-T é a oligomerização dos fragmentos de anticorpos de cadeia única (scFvs) na porção extracelular dos CARs levando, consequentemente, à redução da sua atividade antitumoral. Portanto, este trabalho tem o objetivo de projetar novos fragmentos variáveis de cadeia única (scFv) anti-BCMA, considerando a redução de sua imunogenicidade pela humanização e, adicionalmente do seu potencial de agregação, processo aqui denominado, em conjunto harmonização. Para tal, um scFv anti-BCMA murino disponível na literatura foi utilizado como base para o desenho de versões humanizadas e da versão harmonizada. O potencial de agregação teórico das sequências foi analisado in silico, resultando em três scFvs com graus crescentes de agregação prevista: humanizado, harmonizado e caótico. Os anticorpos foram expressos em formato solúvel em linhagens de Escherichia coli e purificados por métodos cromatográficos. Os resultados da detecção imunológica por western blotting confirmaram a expressão de anticorpos em bactérias transformadas após indução, com um acúmulo dependente do tempo. As análises de exclusão molecular e de espalhamento dinâmico da luz (DLS) corroboram os perfis de agregação previstos, pois o scFv harmonizado exibiu padrões de agregação inferiores em comparação às demais versões de scFvs. Além disso, análises com citometria de fluxo demonstraram que todos os scFvs são capazes de se ligar ao antígeno BCMA expresso em células de linhagem de MM. Com isso, os resultados preliminares possibilitam o aprimoramento da compreensão de agregação de anticorpos e sugerem que a harmonização pode ser aplicada para o desenho de novos CARs.