Decifrando a diversidade e estrutura genética de coleções de germoplasma de Zea Mays L. por meio da alelotipagem de SNPs

Abstract

O Banco Ativo de Germoplasma de Milho (BAG Milho) conta com mais de 4.000 acessos preservados em sua coleção de base. A partir de informações fenotípicas e de origem geográfica foi criada a Coleção Nuclear de Milho, uma amostra representativa da coleção de base, com máxima representatividade de variabilidade genética e mínima redundância. Adicionalmente, foi montada uma coleção de acessos classificados como raças indígenas e/ou originários de terras indígenas. Embora mais de 80% dos acessos do BAG tenham sido caracterizados de acordo com descritores morfológicos da cultura do milho, até o momento, pouco se sabe a respeito da diversidade molecular ampla no genoma, dentro e entre os acessos destas coleções. O conhecimento da diversidade, ancestralidade comum e estrutura genética em nível molecular de uma coleção de germoplasma é uma informação importante para validar e complementar as informações fenotípicas e de origem no desenho de estratégias de conservação e uso de recursos genéticos e melhoramento. Um dos desafios da análise genômica de coleções de germoplasma compostas por grandes números de acessos geneticamente heterogêneos (populações ou variedades não endogâmicas), é lidar com a variação genética existente dentro dos acessos. A genotipagem de vários indivíduos por acesso torna o esforço demorado e caro. A alelotipagem do acesso, ao contrário, estimando as frequências alélicas de uma amostra agrupada de indivíduos de um acesso, representa uma alternativa elegante para análise genética de alta acurácia e baixo custo. Um conjunto de 3.526 SNPs distribuídos no genoma do milho, interrogados no chip EMBRAPA 65kMultiespécies foi usado neste estudo genético. Para avaliar a acurácia do método, três métodos de montagem de pool foram avaliados para quatro acessos diferentes, comparando as estimativas de frequências alélicas obtidas pela razão de intensidade alélica normalizada dos dois alelos ao SNP em pools de 16 plantas por acesso, em três réplicas, com a estimativa das mesmas plantas genotipadas individualmente. Três métodos foram testados: (1). Pool equimolar de DNA extraído individualmente e concentração mensurada em espectrofotometria em equipamento “Nanodrop”; (2). O mesmo que (1), mas o DNA mensurado por fluorimetria com “picogreen”; (3). Extração de DNA a partir de uma amostra consolidada (pool ou bulk) de tecidos foliares das várias plantas, pesados com precisão de 0,1 grama. As frequências alélicas estimadas a partir da genotipagem do DNA preparado com o método (3) de extração foliar em bulk, apresentaram o menor desvio quadrático médio (6,3%) e a maior correlação (0,984) com as frequências alélicas estimadas a partir de plantas individualmente. Usando este método, pools de DNA de 24 plantas de cada um dos 293 acessos da Coleção Nuclear Brasileira de milho e 188 acessos da coleção de milho indígena foram alelotipados. Um conjunto de 64 réplicas biológicas também foi alelotipado para avaliação de reprodutibilidade avaliada pela estimativa de diferenciação genética de Wright. Estimativas precisas das frequências alélicas foram obtidas com erro de amostragem desprezível estimado por um 𝐹𝑆𝑇 médio entre réplicas de 0,0038. Análises de distância genética e estrutura foram realizadas para os 481 acessos juntamente com dados dos mesmos SNPs alelotipados obtidos da literatura para acessos de milho e Teosinto conservados pelo centro internacional CIMMYT (Centro Internacional de Mejoramiento de Maíz y Trigo) representativos de germoplasma tropical, subtropical e temperado. As coleções nuclear e indígena apresentaram diferenciação genética moderada, com um 𝐹𝑆𝑇 médio de 0,136 revelando um padrão de estrutura populacional no qual acessos da coleção nuclear se sobrepuseram a acessos de origem indígena e germoplasma CIMMYT. Entretanto, a coleção indígena apresentou maior diferenciação entre os acessos (𝐹𝑆𝑇 = 0,140) em comparação à coleção nuclear (𝐹𝑆𝑇 = 0,109), o que sugere a necessidade de uma atualização da composição da coleção nuclear incluindo mais acessos indígenas e assim ampliar a diversidade genética representada no germoplasma disponível da espécie. O agrupamento por k-means detectou sete grupos, que continham proporções variáveis de acessos da coleção nuclear e indígena. Padrões de estrutura genética baseados na distância genética, conforme definido pelos dados do SNP, foram encontrados com sobreposição parcial com classificações dos acessos de germoplasma usados no estabelecimento das coleções, tais como tipos de grãos de milho, nível de domesticação e origem do material coletado. No entanto, algumas discrepâncias importantes também foram detectadas onde tais classificações não correspondiam ao que os dados de DNA mostraram. Esses resultados indicam que informações genômicas não enviesadas derivadas dos dados do SNP fornecem informações adicionais importantes que refletem de forma mais precisa a origem ancestral dos acessos de germoplasma. Propomos que os dados genômicos gerados neste trabalho sejam prontamente integrados aos dados de passaporte disponíveis dos acessos estudados para chegar a uma representação mais precisa do germoplasma de milho conservado nas duas coleções.