Desenvolvimento de protocolos de detecção de vírus patógenos de milho (Zea mays) por RT-PCR e RT-qPCR a partir da análise de viroma por HTS

Abstract

O milho (Zea mays L.) é uma das culturas de grãos mais importantes no mundo, com demanda crescente para alimentação humana, ração animal, matéria-prima para indústria e produção de etanol. O Brasil ocupa a terceira posição entre os maiores produtores de milho do mundo, respondendo por 10% da produção global, contudo, sua produtividade (5.495 kg/ha) é significativamente menor quando comparada à produtividade dos EUA (12.344 Kg/ha). A baixa eficiência de manejo de pragas e doenças, que causam cerca de 23% de perdas de produtividade mundial, pode ser um dos fatores responsáveis por essa baixa produtividade. No Brasil, até o momento, há o relato de dez vírus infectando milho, no entanto, apenas cinco têm suas sequências genômicas confirmadas. São eles: maize rayado fino virus - MRFV, gênero Marafivirus, sugarcane mosaic virus – SCMV, gênero Potyvirus, barley yellow dwarf virus PAV – BYDV-PAV, gênero Luteovirus, maize yellow mosaic virus – MaYMV, gênero Polerovirus e maize striate mosaic virus – MSMV, gênero Mastrevirus. Apesar da importância econômica do milho, no Brasil, há uma lacuna nos estudos sobre os vírus que afetam essa cultura (levantamentos de ocorrência e incidência), principalmente devido à falta de métodos padronizados para detecção e identificação dos vírus. Nesse contexto, o presente estudo propõe desenvolver protocolos de detecção para os vírus de milho por RT-PCR e RT-qPCR baseado em SYBR Green, utilizando a base de dados das sequências virais obtidas por highthroughput sequencing (HTS) a fim de garantir a compatibilidade de primers com os isolados circulantes. Inicialmente, amostras foliares de milho de três regiões do Brasil foram analisadas por HTS a fim de determinar a diversidade viral presente na cultura, inclusive com a detecção de potenciais novos vírus ou variantes. A partir desses dados, primers para RT-PCR e RT-qPCR foram desenhados com base nas regiões mais conservadas e controles positivos foram produzidos em vetores plasmidiais. O resultado do HTS apontou a presença de cinco vírus, dos quais quatro são conhecidos no Brasil (MRFV, SCMV, MaYMV e MSMV) e um trata-se do primeiro relato, um vírus de milho umbra-like. Todos foram confirmados por RT-PCR em amostras individuais de milho. Os primers de RT-qPCR foram testados in silico quanto à especificidade, temperatura de desnaturação e probabilidade de “self-dimer” e “hetero-dimer”. Após confirmação das sequências dos controles positivos pelo método Sanger, curvaspadrão de RT-qPCR para cada alvo viral foram produzidas, o número de cópias calculado e o ensaio de RT-qPCR baseado em SYBR Green foi validado com amostras de campo. A análise da curva de dissociação permitiu discriminar os resultados positivos de eventuais amplificações não específicas. A especificidade dos primers também foi confirmada pela visualização de bandas nos tamanhos esperados em gel de agarose. A avaliação das amostras juntamente com o uso de controles negativos e controle interno (gene de referência) permitiu a detecção precisa dos alvos. Assim, os protocolos desenvolvidos podem ser usados para detecção dos patógenos (aplicação qualitativa), em estudos de levantamento e incidência dessas viroses, podendo posteriormente ser testados para fins de quantificação de carga viral.