Edição genômica utilizando a ferramenta CRISPR/Cas9 em células e embriões para inserção de genes de interesse no locus H11 no genoma bovino

Abstract

O Brasil possui o maior rebanho comercial bovino do mundo com mais de 210 milhões de cabeças de gado, além de ser atualmente o maior exportador de carne bovina. Com o crescimento dessa atividade econômica também é crescente a demanda para o emprego de tecnologias avançadas, entre elas a produção de animais geneticamente modificados (AGM) que venham a abordar problemas desde aumento da produtividade até sanidade animal. Com esse projeto, intencionamos investigar o uso do sistema CRISPR/Cas9 como modelo para estabelecimento de uma metodologia de edição genômica visando a inserção (knock-in) direta de genes de interesse biotecnológico, agropecuário, ou industrial no locus H11 do genoma bovino (Bos taurus). Esse estudo analisou em células bovinas a capacidade do sistema CRISPR/Cas9 em inserir cassetes de expressão de um gene repórter (eGFP) em um sítio específico e seguro do genoma, denominado locus H11. Diversos RNA guias foram testados e avaliados quanto sua capacidade de gerar INDELs por meio do ensaio com T7E1 e confirmados com sequenciamento do tipo Sanger. Também foi avaliado o uso de estimuladores e inibidores que poderiam auxiliar no knock-in, como o SCR7 (inibidor da DNA ligase IV), RS-1 (estimulador da Rad51) e L755507 (agonista do receptor β-3 adrenérgico). Em uma segunda fase, foi realizada eletroporação do sistema CRISPR/Cas9 diretamente em zigotos bovinos. Nos zigotos bovinos, foi realizado eletroporação do complexo núcleo-proteico CRISPR/Cas9 (gRNA + proteína Cas9) e do cassete de expressão do eGFP linear, com posterior observação da expressão do gene eGFP nos embriões. Além disso, foi amplificado por PCR a região em que o guia direciona clivagem e realizado sequenciamento do tipo Sanger de tal região para avaliar a ocorrência de INDELs. Os resultados obtidos demonstraram avanços, com a escolha das células MAC-T e a otimização do protocolo de transfecção, o que contribuiu para maior eficiência e viabilidade celular. A utilização do guia Bi5 mostrou potencial, enquanto os compostos RS-1 e L755507 tiveram impacto positivo na inserção do gene eGFP, evidenciando seu potencial para otimizar a recombinação por microhomologia. A inserção do gene em células foi bem sucedida, mas acompanhada de uma inserção inesperada de DNA satélite bovino, ressaltando a complexidade do sistema CRISPR/Cas9. Nos embriões, não foi observada inserção do gene eGFP, sugerindo que ajustes no protocolo experimental são necessários. Esse estudo busca, portanto, a incorporação dos mais recentes avanços no campo da edição genômica direta em genomas complexos como o de mamíferos para criação de soluções inovadoras para biotecnologia animal, como a introdução de genes em um locus específico e seguro do genoma bovino.