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Please use this identifier to cite or link to this item: https://repositorio.unb.br/handle/10482/35043
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Title: Caracterização biofísica de proteínas Vap do sistema toxina-antitoxina de Mycobacterium tuberculosis
Authors: Jardim, Paulo
Orientador(es):: Barbosa, João Alexandre Ribeiro Gonçalves
Coorientador(es):: Valadares, Napoleão Fonseca
Assunto:: Tuberculose - tratamento
Resistência antimicrobiana
Proteínas - metabolismo
Proteínas - estrutura molecular
Issue Date: 11-Jul-2019
Citation: JARDIM, Paulo. Caracterização biofísica de proteínas Vap do sistema toxina-antitoxina de Mycobacterium tuberculosis. 2019. [99] f., il. Dissertação (Mestrado em Biologia Molecular)—Universidade de Brasília, Brasília, 2019.
Abstract: Estima-se cerca de 1,4 milhão de casos de óbito por tuberculose em 2015. Seu agente etiológico, Mycobacterium tuberculosis (Mtb), apresenta diversos mecanismos que propiciam a ocorrência de infecções reincidentes, dentre os quais destaca-se a persistência, que permite que algumas células apresentem um estado caracterizado por uma taxa metabólica muito baixa e tolerância a múltiplos antibióticos. A família de proteínas VapBC faz parte dos sistemas toxina-antitoxina e estão diretamente relacionadas a persistência. Quando em associação, a antitoxina (VapB) neutraliza a toxina (VapC). Fatores ambientais como stress celular podem levar a proteólise da antitoxina, o complexo (VapBC) é então desfeito possibilitando que a VapC exerça sua atividade tóxica de RNAse. Para o trabalho foram selecionadas algumas proteínas da família VapBC: VapB11, VapB17, VapB21, VapB38, VapC19 e VapC20. Os ensaios de expressão foram realizados em meio autoindutor ZYM-5052 utilizando células E. coli LEMO21, a 37 °C e variando o tempo de expressão entre 12 a 15 horas para as VapB, e a 20 °C por 7 horas de expressão para a VapC20. As proteínas foram purificadas por cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados (Ni2+), seguido por cromatografia de exclusão molecular. Ensaios de cristalização automatizados, utilizando as proteínas puras e kits de cristalização comercialmente disponíveis permitiu a observação de micro cristais para as proteínas VapB17, VapB38, VapC19 e VapC20, que seguiram para etapa de refinamento manual. Outros experimentos como ultracentrifugação analítica SDS-PAGE, PAGE-nativo e dicroísmo circular (DC) foram realizados para estas proteínas, a fim de elucidar características estruturais. A VapC19 apresentou um perfil oligomérico de dímero. Todas as VapB apresentaram duas populações oligoméricas: VapB38 (dímeros e tetrâmeros), VapB21 (dímeros e hexâmeros) e VapB11 (monômeros e dímeros). Análises de DC proveram Tm de 75 ºC para a VapB38 e 70 °C para a VapB17, além de informações estruturais sobre as antitoxinas.
Abstract: Tuberculosis is one of the world's deadliest diseases according to the World Health Organization and being among the top 10 causes of death worldwide. It was estimated that around one-third of the world's population is infected with the pathogen Mycobacterium tuberculosis (Mtb), but the majority present the latent form of the disease. Persistent cells are genetically identical to non-persistent cells, but exhibit a phenotype characterized by slow growth, low metabolic rate and multidrug tolerance. VapBC, virulence-associated proteins, code for 47 pairs of toxin-antitoxin systems in Mtb H37Rv strain and are directly associated to persistence. The toxins (VapC) present RNAse activities that reduce the Mtb metabolism, while the antitoxins (VapB) bind to and inhibit the cytotoxic effects of their cognate toxins. Under stress conditions, the antitoxin molecules are degraded by proteases and the toxin is released to exert activity. In this study, we analyze the proteins associated with the phenomenon of persistence due to its direct relationship with mechanisms related to recurrent infections and drug resistance. Fine-tuned expression assays and multiple purification steps were performed in order to obtain high purity soluble VapC toxins and VapB antitoxins in reasonable quantities for biophysical and biochemical assays. Circular dichroism, sedimentation velocity analytical ultracentrifugation, SDS-PAGE, native-PAGE and protein crystallization assays are among the techniques employed. Our main goal is to characterize the VapBC systems structurally and relate it to the persistence of Mtb, associating structure to function. VapB11, VapB17, VapB21, VapB38, VapC19 and VapC20 proteins were expressed and purified in appropriate purity and quantity to allow their biophysical characterization and the development of crystallization assays. We determined some crystallization conditions for the toxins, as well as thermal stabilities and oligomerization states for antitoxins. This work could contribute to a better understanding of Mtb persistence, providing new information to targets candidates for treatment. AUC data show that all four VapB present two different oligomeric populations: VapB38 (dimers and tetramers), VapB21 (dimers and hexamers) and VapB11 (monomers and dimers). For VapC19 samples, we observed a dimer profile. Circular dichroism analysis led to a Tm of 75 ° C for VapB38 and 70 ° C for VapB17. In addition, we show structural information for the antitoxins.
Description: Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2019.
Licença:: A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.
Agência financiadora: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).
Appears in Collections:CEL - Mestrado em Biologia Molecular (Dissertações)

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