Estudo dos fatores que influenciam a predominância do begomovírus Tomato severe rugose virus no Brasil

Abstract

O tomateiro é uma das principais hortaliças cultivadas no país, sendo também uma das culturas que mais sofre danos pelo ataque de diversos patógenos. Dentre os patógenos de origem viral que infectam o tomateiro as principais espécies são Tomato sereve rugose virus – ToSRV e Tomato golden vein virus – TGVV (Begomovirus); Tomato spotted wilt virus – TSWV e Grounut ringspot virus - GRSV (Tospovirus); Cucumber mosaic virus – CMV (Cucumovirus); Peper yellow mosaic virus - PepYMV e Potato virus Y - PVY (Potyvirus) e; Tomato mosaic virus – ToMV (Tobamovirus); e mais recentemente Tomato chlorosis virus - ToCV (Crinivirus). Os begomovírus se destacam, na atualidade, devido à diversidade de espécies e pela maior incidência na cultura. Esses vírus pertencem à família Geminiviridae, podem apresentar um ou dois (DNA-A e DNA-B) componentes genômicos e são transmitidos por moscas-brancas, insetos sugadores de seiva. O objetivo deste trabalho foi avaliar o grau de susceptibilidade de materiais de tomate plantados no país a oito dos principais vírus que afetam a cultura; determinar as espécies de begomovírus predominantes no país nos anos de 2009-2010, e estudar os fatores que influenciam na predominância de ToSRV nas regiões produtoras de tomate do Brasil. Inicialmente, foi feita uma avaliação da resistência de materiais de tomate comumente plantados no país a oito dos principais vírus que afetam a cultura. A avaliação da resistência dos materiais de tomate foi determinada a partir da inoculação de isolados de CMV, PVY, PepYMV, TSWV, GRSV e ToMV (inoculação mecânica) e de ToSRV e TGVV (inoculação por mosca-branca). Como resultado, não foi verificado materiais com resistência do tipo imunidade para cinco das oito espécies de vírus avaliadas. Foram verificados materiais resistentes apenas para isolados das espécies TSWV, ToMV e PVY, sendo que para os demais vírus todas as cultivares apresentaram-se como susceptíveis. Apenas algumas cultivares (somente para o segmento mesa) mostraram níveis diferentes de resistência para o isolado de begomovírus ToSRV avaliado. A partir de então, os estudos foram direcionados para os begomovírus visando determinar as espécies atualmente predominantes no país (coletas nos anos 2009-2010) e estudar os fatores que influenciam na predominância de ToSRV nas regiões produtoras de tomate do Brasil. Para o estudo de prevalência das espécies de begomovírus, as amostras isoladas de tomateiro foram coletadas nas principais regiões produtoras de tomate do país. O DNA total foi extraído e os begomovírus foram detectados por PCR. As amostras positivas foram selecionadas e essas foram amplificadas por RCA (amplificação por círculo rolante) seguido pela caracterização a partir da digestão com enzima de corte freqüente MspI. A análise da diversidade foi realizada por eletroforese com a separação em padrões de migração de fragmentos de DNA. Ao todo foram analisadas 600 amostras positivas e 36 padrões de digestão foram selecionados. Uma amostra de cada padrão foi selecionada aleatoriamente e o DNA-A dos begomovírus presentes nas amostras foram seqüenciados parcialmente (sequenciamento direto do RCA) e apenas as espécies distintas estão sendo clonadas e seqüenciadas completamente. Como resultado houve predominância de ToSRV, seguido de Tomato mottle leaf curl virus (TMoLCV). Em paralelo, isolados de ToSRV e TGVV, espécies mais relatadas como predominantes no país, sendo que TGVV vem aparentemente reduzindo sua incidência, foram selecionados para a avaliação do processo de infecção e o estudo de transmissão por moscas-brancas. O círculo de hospedeiras de plantas cultivadas e daninhas para os vírus TGVV e ToSRV foi determinado, indicando um círculo de hospedeiros semelhante entre eles. Adicionalmente, a cinética de infecção foi avaliada em agroinoculação com TGVV e ToSRV em infecção simples e mista. O monitoramento consistiu na observação de sintomas e coleta de amostras foliares para posterior detecção por PCR a cada três dias, para determinar a velocidade de infecção e a porcentagem de plantas infectadas com cada vírus. Para os ensaios de transmissão, inicialmente foram aperfeiçoados os protocolos de inoculação por mosca-branca, avaliando a forma de aquisição, inoculação, a quantidade de insetos por planta e a cultivar de tomate utilizada como planta-teste. Como metodologia-padrão foi adotado o uso da cultivar Viradoro, a aquisição a partir de folhas destacadas de tomateiro infectado em tubos de polietileno e três insetos/planta confinados em copos plásticos para a inoculação. Os períodos de aquisição e inoculação do inseto-vetor foram padronizados em 48h. Para a determinação da eficiência de transmissão foram realizados ensaios com infecção simples e mista. Foi determinada também a porcentagem de aquisição dos vírus pelo inseto-vetor após 48h de inoculação em insetos alimentados em folhas com infecção simples e mista. Como resultado, não houve diferença significativa entre as taxa de aquisição de ToSRV e TGVV em insetos alimentados em folhas com infecção simples e mista. Mas, a porcentagem de infecção por ToSRV em plantas inoculadas por vetor e por agroinoculação (inoculação simples ou mista) foi invariavelmente superior à taxa de infecção por TGVV em todos os ensaios realizados. Verificou-se que a infecção de tomateiro pelo isolado de ToSRV é mais eficiente quando comparado com a infecção por TGVV. Em infecções simples e mistas, a taxa de plantas infectadas com ToSRV foi maior em todos os ensaios. Em conclusão, muito provavelmente a predominância de ToSRV em campo está relacionada com a maior eficiência de colonização e infecção do ToSRV em tomateiro e também com a maior eficiência de transmissão pela mosca-branca de ToSRV, sugerindo a excelente adaptação dessa espécie em tomateiro em condições de cultivo no Brasil. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT

The tomato plant is one of the major vegetable grown in the country and is also the crop most damaged by numerous pathogens. Among the main viral diseases that affect this crop, the following viruses are specially important: Tomato severe rugose virus - ToSRV and Tomato golden vein virus (Begomovirus), Tomato spotted wild virus - TSWV and Groundnut ringspot virus - GRSV (Tospovirus), Cucumber mosaic virus - CMV (Cucumovirus); Pepper yellow mosaic virus - PepYMV and Potato virus Y - PVY (Potyvirus), and Tomato mosaic virus - ToMV (Tobamovirus), and more recently Tomato chlorosis virus - ToCV (Crinivirus). At present, begomoviruses are considered the most important viruses, given the species diversity and high incidence. These viruses belong to the family Geminiviridae, have one or two (DNA-A and DNA-B) genomic components, and are transmitted by sap-sucking whiteflies. The main objective of the present work was to evaluate the susceptibility of tomato materials cultivated in the country to the eight major viruses affecting the crop, to determine the begomovirus species prevalence in the country within 2009-2010, and to study the factors that influence the prevalence of ToSRV in tomato producing areas of Brazil. Initially, the resistance of tomato materials commonly planted in the country was evaluated to eight of the major viruses affecting this crop. Resistance was evaluated against inoculation of CMV, PVY, PepYMV, TSWV, ToMV and GRSV (mechanical inoculation), and ToSRV and TGVV (inoculation by whitefly). As a result, no immune-like resistance was observed against five out of eight tested virus species. Resistant materials were only found for TSWV, ToMV and PVY, whereas for the other viruses all cultivars were classified as susceptible. Only for begomoviruses, some cultivars (only for fresh market) showed different levels of resistance to isolates of begomoviroses. Then, the studies were focused on begomoviruses, and aimed to determine the current prevalent species in the country (collected within years 2009-2010) and to study the factors that influence the prevalence of ToSRV on tomatoes in Brazil. For the study on the prevalent begomovirus species, tomato isolates were sampled in the main growing regions of the country. Total DNA was extracted and the begomoviruses were detected using PCR. The positive samples were selected and they were amplified by RCA (rolling circle amplification) followed by genotyping by digestion with the frequent cutting enzyme, MspI. The diversity analysis was performed by comparison of migration patterns of digested DNA fragments in an agarose gel. A total of 600 positive samples were analyzed and 36 migration patterns were detected. One sample from each pattern was randomly selected, the DNA-A of each begomovirus present in the sample was partially sequenced (direct sequencing of RCA), and only the different species are being cloned and sequenced completely. As a result ToSRV was the predominant species, followed by Tomato mottle leaf curl virus (TMoLCV). In parallel, isolates of ToSRV and TGVV, species reported as more prevalent in the country, being TGVV apparently reducing in its incidence, were selected for the studies on the infection process and transmission by whiteflies. TGVV and ToSRV host range, including weeds and crops, was determined. Additionally, the infection kinetics was evaluated by agroinoculation of TGVV and ToSRV in single and mixed infections. Infection was monitored by symptom observation and virus detection by PCR from leaf samples collected every three days to determine the infection rate and percentage of plants infected with each virus. For the transmission tests, the whitefly inoculation protocols were initially optimized, by evaluating the procedure of acquisition, of inoculation, the number of insects per plant and the tomato cultivar used as the test plant. The standard methodology was defined by using the Viradoro cultivar, acquisition from infected detached tomato leaves in polyethylene tubes, and three insects per plant confined in plastic cups for inoculation. The acquisition and inoculation access periods were standardized in 48 hours. The transmission efficiency tests were performed with single and mixed infections. Additionally, the percentage of whiteflies that had acquired the virus 48h after inoculation was determined in single and mixed infections. As a result, no significant difference was found between the acquisition rate of ToSRV and TGVV in insects fed on leaves with single and mixed infections. However, the infection percentage of plants agro or vector-inoculated with ToSRV (single or mixed inoculation) was invariably higher than the rate of infection of TGVV in all tests. Infection of tomato plants by the ToSRV isolate was more efficient than infection with TGVV. In single and mixed infections, the rate of infected plants by ToSRV was higher in all tests. In conclusion, most probably the predominance of ToSRV in the field is related to the efficiency of colonization and infection of ToSRV in tomato plants and also to the higher efficiency of whitefly transmission, suggesting the excellent adaptation of this species in tomato under growing conditions in Brazil.