Avaliação e caracterização da atividade holocelulolítica de isolados de Clostridium thermocellum

Abstract

O uso de biomassa lignocelulósica como matéria-prima para a produção de etanol combustível se inicia pela intensa hidrólise de suas estruturas para a obtenção de açúcares fermentáveis. Neste contexto, o objetivo geral deste trabalho foi avaliar a produção de atividades enzimáticas celulolíticas e hemicelulolíticas de dois isolados da bactéria anaeróbica termófila Clostridium thermocellum (ISO1 e ISO2), quando cultivados em meio de cultura contendo celulose cristalina e bagaço de cana-de-açúcar, assim como, analisar o perfil de proteínas secretadas em cada uma destas condições, visando o mapeamento de proteínas envolvidas na degradação destas biomassas. O pH e temperatura ideais para o cultivo dos isolados são pH 7 e 60°C. Os isolados secretam atividade celulolítica, xilanolítica e pectinolítica quando cultivados em meio de cultura contendo celulose cristalina ou bagaço de cana de açúcar como única fonte de carbono. Estas atividades foram detectadas no sobrenadante do meio de cultura e também associadas ao substrato residual, sendo que o maior valor de atividade 0,478 UI/mL foi detectado para a atividade xilanolítica no sobrenadante de ISO2 cultivado em bagaço de cana. Além disso, os isolados foram capazes de degradar celulose cristalina com atividades de 0,052UI/mL e 0,040 UI/mL obtidas para as proteínas eluídas do substrato residual celulósico e proteínas secretadas no meio de cultura com bagaço de cana de ISO2, respectivamente. O perfil protéico do sobrenadante e proteínas associadas ao substrato residual foi analisado por eletroforese SDS-PAGE, no qual foi observada a presença de proteínas de 160 e 220kDa, com perfil semelhante ao celulossoma de um isolado de C. thermocellum utilizado como controle (Cth JW). Adicionalmente, os sobrenadantes das culturas foram utilizados como fonte de proteínas para as análises em géis bidimensionais, 2-DE, nos quais foram observadas diferenças no número e volume de spots entre as condições de crescimento, e na comparação dos isolados ISO1 e ISO 2 com o isolado padrão. A espectrometria de massas MALDI-TOF foi utilizada na identificação de proteínas do secretoma do ISO2 cultivado em celulose como fonte de carbono. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT

The use of lignocellulosic biomass as feedstock for bioethanol production begins with the intense hydrolysis of its structure to obtain fermentable sugars. The present work aims the evaluation of cellulolytic and hemicellulolytic activities production from two strains of the thermophilic anaerobic bacterium Clostridium thermocellum (ISO1 e ISO2), after growth on crystalline cellulose and sugarcane bagasse, also, the protein profile secreted by these isolates was resolved by SDS-PAGE and 2DE electrophoresis aiming the identification of proteins that participate on the cellulosic raw material degradation. The pH and temperature for optimal growth of the isolates are pH 7 and 60 ° C. The bacterium isolates produce cellulolytic, xylanolytic and pectinolytic activities when cultured in liquid medium containing crystalline cellulose or sugar cane bagasse as the sole carbon source. These activities were detected in the supernatant of the culture medium and also associated with the residual substrate, and the highest value was obtained for the xylanolytic activity (0.478 UI/ mL) from the supernatant of ISO2 grown on sugarcane bagasse. Moreover, the isolates were capable to degrade crystalline cellulose, with activities of 0.052 UI/mL and 0.040 UI/mL for the protein sample eluted from the residual substrate and secreted proteins into the culture medium with sugarcane bagasse ISO2, respectively. The protein profile of the supernatant and substrate associated proteins were analyzed by SDS-PAGE, and the presence of 160 e 220kDa proteins with a similar profile to the cellulosome of a C. thermocellum was observed. Additionally, the culture supernatants were used as a source of proteins for the analysis in two-dimensional gels, 2-DE, and there were differences in the number of spots and its volume between the growth conditions, and in comparison of the two strains ISO1 and ISO and the standard isolate CthJW. Mass spectrometry MALDI-TOF was used to the identification of ISO2’s secretome proteins after growth in liquid medium containing cellulose as carbon sources.