Evolução molecular na interação planta-praga : uma nova proteína inibidora de xilanase (XIP), similar a quitinases de classe III de plantas, que afeta a germinação de esporos da ferrugem asiática (Phakopsora pachyrhizi)

Abstract

Uma busca por novas proteínas entomotóxicas de Bacillus thuringiensis S811 indicou que a atividade enzimática quitinolítica contribuía para a toxicidade dessa cepa contra o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis). Durante os experimentos para a construção de uma molécula recombinante efetiva contra A. grandis e que fosse formada pela fusão de uma quitinase com uma toxina Cry, uma nova classe de Proteínas Inibidoras de Xilanases (XIP) foi descoberta dentro da família 8 de Proteínas Relacionadas a Patogênese (PR-8) de Café (Coffea arabica), a qual compreende as quitinases de classe III de plantas. Tal proteína foi denominada CaclXIP (Coffea arabica Chitinase-Like Xylanase Inhibitor Protein). O gene codificador da proteína inibidora de xilanase paráloga a quitinases de classe III de café (CaclXIP) foi isolado a partir de folhas e subclonado no vetor pGAPZα-B para expressão em Pichia pastoris. Sua seqüência de aminoácidos, que prediz uma topologia do tipo barril (β/α)8, comum a quitinases de classe III de plantas (família 18 das glicosil hidrolases (GH18)), partilha alta similaridade com outros membros da família GH18, embora ela careça do ácido glutâmico catalítico, que encontra-se substituído por uma glutamina. Ensaios de atividade enzimática com a proteína recombinante purificada mostraram que CaclXIP não apresenta atividade quitinolítica, contudo esta molécula mostrou-se capaz de inibir em 57% a atividade de xilanases de Acrophialophora nainiana em uma proporção de 12:1 (enzima:inibidor). Adicionalmente, quando testada a 1,5 μg/μL, CaclXIP foi capaz de inibir em 45% a germinação de esporos de Phakopsora pachyrhizi, o agente causador da Ferrugem asiática, uma doença de difícil controle que afeta severamente os campos de soja no Brasil. Estes resultados indicam que CaclXIP pertence a uma classe de proteínas sem atividade enzimática que evoluiu dentro da família das quitinase de classe III de plantas. Assim como as quitinases, essas novas proteínas também atuam na defesa vegetal, porém como inibidores de xilanases. Seu papel na interferência da germinação de esporos de P. pachyrhizi faz dela uma molécula candidata em potencial para programas biotecnológicos que visem o controle da Ferrugem asiática. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT

Looking for a new entomotoxins from Bacillus thuringiensis S811, It has been realized that chitinolytic activity of those bacterial protein extracts could contribute to the strain toxicity towards the cotton boll-weevil (Anthonomus grandis). During experiments to construct one recombinant molecule lethal to A. grandis, and formed by a fusion between a chitinase and a Cry toxin, a new class of Xylanase Inhibitor Proteins (XIP) was discovered into Pathogenesis Related Proteins family 8 (PR-8) from Coffee (Coffea arabica), comprehending plants Class III Chitinases. This molecule was named CaclXIP (Coffea arabica Chitinase-Like Xylanase Inhibitor Protein). The gene for a xylanase inhibitor protein (XIP), which is paralogous to class III chitinase from coffee (CaclXIP), has been isolated from leaves and subcloned into pGAPZα-B vector to be expressed in Pichia pastoris. Its amino acid sequence, that predicts a (β/α)8 topology common to Class III Chitinases (glycoside hydrolase family 18 proteins (GH18)), share high similarity with other GH18 members although it lack the catalytic glutamic acid, which is replaced by a glutamine amino acid residue. Enzymatic assay using purified recombinant CaclXIP showed no chitinolytic activity. On the other hand, it has been capable to inhibit xylanases from Acrophialophora nainiana in a 57% rate when assayed at a 12:1 (enzyme:inhibitor) ratio. Additionally, when tested at 1.5 μg/μL, CaclXIP was able to inhibit about 45% the germination of spores of Phakopsora pachyrhizi, the agent of Soybean Asian rust, a harsh disease difficult to control in Brazilian soybean fields. These achievements indicate that CaclXIP belongs to a class of proteins without enzymatic activity, which evolved from plants class III quitinase family. Like chitinases, theses new proteins works on plant defence too, but as xylanase inhibitors. Moreover, its role in arresting P. pachyrhizi spores germination makes it an eligible candidate to biotechnological programs aiming the asian rust control.