Evolução in vitro e seleção de variantes cry para o controle da broca-gigante da cana-de-açúcar

Abstract

A cultura da cana-de-açúcar desde sempre reteve destacada relevância para a economia brasileira decorrente dos produtos que gera e pela demanda premente da utilização de biocombustíveis renováveis na matriz energética atual. Todavia, inúmeras doenças e pragas persistem e precisam ser continuamente estudadas de forma a se obter variedades geneticamente melhoradas e resistentes. O potencial biotecnológico das d-endotoxinas produzidas em inclusões cristalinas provenientes de bactérias formadoras de esporos, a exemplo do Bacillus thuringiensis, é amplamente estabelecido. Nesta assertiva, buscou-se construir uma biblioteca de variantes do gene cry1Ia12synth e selecionar variantes codificadoras de toxina Cry1Ia12synth com atividade entomotóxica diferenciada contra larvas de broca gigante (Telchin licus licus) da cana-de-açúcar, por meio da estratégia de utilização combinada das técnicas de DNA shuffling (evolução molecular in vitro) e Phage display (apresentação em superfície de fagos). Novas toxinas foram selecionadas por varredura de moléculas afins das proteínas presentes nas vesículas de membrana do intestino médio de larvas de T.l.licus. Centenas de variantes foram analisadas e 30 delas foram escolhidas para serem expressas em fagos e avaliadas por bioensaios de atividade entomotóxica. Os resultados mostraram que 4 variantes apresentaram atividade entomotóxica específica aumentada em mais de 2 vezes quando comparadas a toxina original. Os genes codantes destas proteínas mutantes foram seqüenciados e as proteínas correspondentes tiveram a estrutura simulada por meio de técnicas de modelagem molecular por homologia, para estudar possíveis implicações das mutações sobre a atividade tóxica. Os estudos moleculares revelaram pequenas variações no contato e distância entre alguns átomos das proteínas mutantes em relação à proteína original. No entanto, tais modificações foram insuficientes para determinar a causa da atividade diferenciada entre mutantes e original, indicando a necessidade de estudos adicionais de interação entre a proteína Cry e o receptor. Portanto, os resultados obtidos validam a estratégia utilizada e disponibilizam novas moléculas candidatas ao controle desta praga em futuros eventos de geração de cana-de-açúcar geneticamente modificada. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Sugarcane crop has always been important for the Brazilian economy due to its subproducts and the imminent demand in its use as a source of renewable biofuels. However, many diseases and insect-pests persist and need to be continuously investigated to result in the development of genetically improved varieties. The biotechnological potential of d-endotoxins produced in crystalline inclusions from Bacillus thuringiensis spore-forming bacteria is widely established. In this context, we built a library of cry1Ia12synth variant genes coding Cry1Ia12synth toxin with improved entomotoxic activity against sugarcane giant borer (Telchin licus licus), through the combined use of DNA shuffling and phage display techniques. Novel toxins were selected by screening for binding protein present within brush border membrane vesicles from T. l. licus midgut. Hundreds of variant toxins were analyzed and 30 were chosen to be expressed in phages and evaluated by bioassays of entomotóxica activity. The results showed that 4 variant toxins had specific entomotoxic activity increased by more than two times compared to original toxin. The genes coding these mutant proteins were sequenced and the structures of the corresponding proteins were solved by homology molecular modeling, to evaluate possible implications of mutations on the entomotoxic activity. The molecular studies revealed minor variations in relation to the contact and distance among certain atoms within the mutant proteins as compared to the original one. Nevertheless, these variations were insufficient to determine the cause of the differential activities among mutants and original protein, indicating the need additional studies of interactions between Cry protein and receptor. Therefore, the results validate the strategy used and provide novel candidate molecules to control this pest in transforming events of genetically modified sugarcane.