Identificação e caracterização funcional de atividade apirásica nas salivas de triatomíneos vetores da Doença de Chagas

Abstract

Os artrópodes hematófagos são capazes de neutralizar defesas do hospedeiro durante repasto, devido à presença de ampla variedade de fatores anti-hemostáticos presentes em suas salivas como vasodilatadores, fatores antiplaquetários e anticoagulantes. O principal mecanismo de transmissão da Doença de Chagas é a contaminação do hospedeiro por excretas de triatomíneos infectados. O Triatoma infestans Klug, 1834, o principal vetor do mal de Chagas no Brasil, possui várias apirases em sua saliva que inibem a agregação plaquetária do hospedeiro. Neste estudo, nós mostramos que as apirases de 88, 82 e 79 kDa desse inseto são antigenicamente distintas e localizam-se na unidade D2 de sua glândula salivar. O conteúdo de uma unidade D2, e não os das outras, foi capaz de inibir a agregação de plaquetas, induzida por ADP, presentes em 1 mL de sangue. Em adição, identificamos pela primeira vez atividades apirásicas nos conteúdos de glândulas salivares de Rhodnius brethesi Matta, 1919; Rhodnius milesi Carcavallo, Rocha, Galvão, Jurberg & Valente 2001; Rhodnius pictipes Stal, 1872 e Rhodnius robustus Larrousse, 1927 por meio de testes enzimáticos utilizando ATP e ADP como substratos. Os ensaios enzimáticos, realizados a 37 °C e pH 8,3, revelaram que as atividades apirásicas são dependentes de cálcio. As atividades apirásicas das glândulas salivares de R. brethesi e R. pictipes foram parcialmente purificadas em coluna de Oligo dT Celulose. Para identificação de proteínas relacionadas com essa atividade, extratos glandulares e frações eluídas da coluna de Oligo dT, não fervidos e não reduzidos, foram submetidos à enzimografia após separação em SDS-PAGE. Este experimento revelou bandas de proteínas com atividades ATPásicas e ADPásicas de aproximadamente 44-45 kDa. Adicionalmente, experimentos de agregação plaquetária realizados in vitro demonstraram que 0,5 par de glândula salivar de R. brethesi, R. milesi, R. pictipes e R. robustus inibiram totalmente a agregação plaquetária induzida por ADP. Diferentemente das apirases de T. infestans, as de Rhodnius spp. são de baixa massa molecular e não fazem parte da família das 5´nucleotidases. A ampla distribuição das apirases nas salivas dos vetores da doença de Chagas e de outros artrópodes indica que estas enzimas têm importância fundamental na hematofagia.